Rakkude taaselustamine pärast krüokonserveerimist

Rakke, kudesid ja isegi mõningaid liike saab pikema aja jooksul säilitada ja seejärel edasiseks uurimiseks taastada. Selles artiklis vaadeldakse erinevaid protseduure, mida kasutatakse rakkude üles sulatamiseks krüosäilitamisel, ning antakse juhiseid rakkude taaselustamiseks ja nende elujõulisuse tagamiseks. Oluline on siiski hoolikalt järgida rakukultuuride tarnija antud juhiseid.

Peamised järeldused

• Rakkude sulatamine on oluline samm krüokonserveerimise protsessis, mis hõlmab külmutatud rakkude järkjärgulist soojendamist toatemperatuurini.
• Vähirakkude ja tüvirakkude sulatamiseks on soovitatav sulatada viaale aeglaselt, sest see vähendab rakkude kahjustamise ohtu.
• Sulatamise ajal on sulatamiskiirus, temperatuur ja kokkupuude krüoprotektandiga kõik tegurid, mis võivad rakke kahjustada.
• Rakkude taaselustamine eeldab nende varustamist kasvuks vajalike toitainete ja mineraalidega.
• Pärast rakkude taaselustamist ja enne nende kasutamist katsetes tuleb kontrollida rakkude kahjustusi ja elujõulisust ning jälgida nende kasvu ja paljunemist.
• Rakkude eduka sulatamise ja taaselustamise tagamiseks on oluline järgida soovitatud suuniseid ja protokolle, käidelda rakke ettevaatlikult ja pidada täpset arvestust.

Sulatamisprotokoll

1. Sulatage rakud kiiresti 37 °C veevannis 1-2 minuti jooksul, kuni krüoviaalis on alles vaid väike jääklomp.
   • Alates sellest hetkest tuleb kõik protseduurid teostada aseptilistes tingimustes.
2. Viige krüoviaal desinfitseeritud steriilsesse voolukappi.
3. Avage viaal ettevaatlikult ja kasutage 2 ml seroloogilist pipetti, et määrata rakkude koguarv, mõõtes rakulahuse kogumahtu. Seejärel eemaldage 20 µl rakke loendamiseks alikvoodina.
4. Asetage rakususpensioon 15 ml tsentrifuugitorusse, mis sisaldab 8 ml kultuurkeskkonda (toatemperatuuril).
5. Suspendeerige rakud ettevaatlikult.
6. Tsentrifuugige 3 minutit 300 x g juures ja visake supernatant ära.
   • Tsentrifuugimise võib ära jätta ja rakud kohe rakukultuurikolbi asetada, kuid 24 tunni pärast tuleb kindlasti vahetada söötme.
7. Rakud asetatakse kohe 10 ml värskesse rakukultuurikeskkonda (eelnevalt toatemperatuurini või inkubaatoris 37 °C-ni soojendatud), et anda kasvutoiteained ja lahjendada krüoprotektant, näiteks DSMO. DMSO kui krüoprotektant kaitseb rakke külmutamisest põhjustatud kahjustuste eest, takistades jääkristallide moodustumist, kuid see võib suurtes kontsentratsioonides olla rakkudele toksiline. Kaks T25 rakukultuurikolbi tuleb täita rakkudega.
8. Asetage rakud inkubaatorisse ja vahetage järgmisel päeval keskkonda.
9. Jätkake taaselustatud rakkude inkubeerimist vastavalt selle konkreetse rakuliini jaoks antud juhistele.
10. Enne katsete läbiviimist laske sulatatud rakkudel kultuurkeskkonnas taastuda, et rakud saaksid taastuda sulamisstressist. Samuti kontrollige rakkude kahjustusi ja elujõulisust mikroskoopilise vaatluse või elujõulisuse testi abil ning jälgige rakkude kasvu.

Märkus: Ärge unustage otsida ja määrata oma rakkudele_sobiv inkubatsioonitemperatuur ja_CO2 ! Enamikku rakke inkubeeritakse 37 °C juures, kuid mõned putukarakud vajavad näiteks madalamat temperatuuri.

Miks on rakkude sulatamine stressirohke?

Sulatamise käigus puutuvad rakud kokku allpool kirjeldatud potentsiaalselt kahjulike keskkonnamuutustega:

• Temperatuurimuutused: Rakke võib kahjustada üleminekul krüogeenselt temperatuurilt soojemale temperatuurile. Sulatamise ajal toimuv termiline šokk võib kahjustada membraane, ensüüme ja teisi rakke.
• Osmootilised muutused: Osmootilise rõhu kõikumised sulatamise ajal võivad kahjustada rakumembraani ja muid struktuure. DMSO või glütserooliga krüokonserveeritud rakkudesse võivad sattuda mürgised ained.
• Krüoprotektandi eemaldamine: Krüoprotektante lisatakse rakkudele enne külmutamist, et vältida jääkristallide teket, kuid need on toksilised, kui neid ei eemaldata pärast sulatamist.
• PH muutumine: pH muutumine sulatamise ajal võib rakke stressida. Temperatuurimuutused või ainevahetusjäätmete vabanemine võivad põhjustada pH muutusi.
• Mehhaaniline stress: Kuna rakke pipetitakse ja tsentrifuugitakse sulatamise ajal, võib tekkida mehaaniline pinge. See võib kahjustada rakke ja vähendada nende elujõulisust.

Sulatamine võib rakke stressida ning kahjustada nende elujõulisust ja funktsiooni. Krüokaitsevahendid ja hea sulatamisprotokoll võivad seda kahjustust vähendada.

5 nõuannet rakkude edukaks sulatamiseks ja taaselustamiseks

1. Kasutage rakkude sulatamiseks protokolli, mis vastab sulatatavate rakkude tüübile, näiteks vähirakkude ja tüvirakkude puhul aeglast sulatamistehnikat.
2. Vähendage rakkude kahjustamise riski minimeerimiseks kokkupuudet kõrge temperatuuri ja pikema sulatamisajaga.
3. Sulatamise ja taaselustamise ajal käsitsege rakke ettevaatlikult, et vältida kahjustusi.
4. Kontrollige rakke kahjustuste ja elujõulisuse suhtes ning jälgige nende kasvu enne nende kasutamist katsetes.

Järgige krüokonserveeritud rakkude sulatamisel ja taaselustamisel soovitatud protokolle ja suuniseid.