Oživení buněk po kryokonzervaci

Buňky, tkáně, a dokonce i některé živočišné druhy lze uchovávat po delší dobu a poté je obnovit pro další studium. Tento článek se zabývá různými postupy používanými pro rozmrazování buněk při kryokonzervaci a poskytuje návod pro oživení a zajištění životaschopnosti buněk. Je však důležité důsledně dodržovat pokyny poskytovatele buněčných kultur.

Klíčové poznatky

• Rozmrazování buněk je klíčovým krokem v procesu kryokonzervace, který zahrnuje postupné zahřívání zmrazených buněk na pokojovou teplotu.
• Pro rozmrazování nádorových a kmenových buněk se doporučuje rozmrazovat lahvičky pomalu, protože se tím snižuje riziko poškození buněk.
• Během rozmrazování jsou rychlost rozmrazování, teplota a působení kryoprotektiva faktory, které mohou způsobit poškození buněk.
• Oživení buněk vyžaduje poskytnout jim živiny a minerály, které potřebují pro svůj růst.
• Po oživení buněk a před jejich použitím v experimentech je nutné zkontrolovat, zda nejsou buňky poškozeny a životaschopné, a také sledovat jejich růst a proliferaci.
• Pro zajištění úspěšného rozmrazení a oživení buněk je nezbytné dodržovat doporučené pokyny a protokoly, zacházet s buňkami opatrně a vést přesné záznamy.

Protokol o rozmrazování

1. Buňky rychle rozmrazujte ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 1 až 2 minut, dokud v kryovialu nezůstane jen malý ledový chuchvalec.
   • Od tohoto okamžiku musí být všechny postupy prováděny za aseptických podmínek.
2. Přeneste kryovialku do dezinfikované sterilní průtokové skříně.
3. Opatrně otevřete lahvičku a pomocí 2ml sérologické pipety určete celkový počet buněk změřením celkového objemu buněčného roztoku. Poté odeberte 20 µl buněk pro počítání jako alikvotní část.
4. Vložte buněčnou suspenzi do 15 ml centrifugační zkumavky, která obsahuje 8 ml kultivačního média (pokojová teplota).
5. Buňky opatrně suspendujte.
6. Odstřeďujte 3 minuty při 300 x g a supernatant zlikvidujte.
   • Krok centrifugace lze vynechat a buňky ihned umístit do baňky s buněčnou kulturou, ale nezapomeňte po 24 hodinách vyměnit médium.
7. Buňky ihned umístěte do 10 ml čerstvého média pro kultivaci buněk (předehřátého na pokojovou teplotu nebo na 37 °C v inkubátoru), abyste zajistili růstové živiny a zředili kryoprotektivum, například DSMO. DMSO jako kryoprotektant chrání buňky před poškozením způsobeným zmrazením tím, že zabraňuje tvorbě ledových krystalků, ale ve vysokých koncentracích může být pro buňky toxický. Dvě baňky s buněčnými kulturami T25 by měly být naplněny buňkami.
8. Umístěte buňky do inkubátoru a následující den vyměňte médium.
9. Pokračujte v inkubaci oživených buněk podle pokynů pro tuto konkrétní buněčnou linii.
10. Před prováděním experimentů nechte rozmražené buňky oživit v kultivačním médiu, aby se buňky mohly zotavit ze stresu způsobeného rozmražením. Také zkontrolujte poškození a životaschopnost buněk mikroskopickým pozorováním nebo provedením testu životaschopnosti a sledujte růst buněk.

Poznámka: Nezapomeňte vyhledat a nastavit inkubační teplotu a_{CO2 vhodné pro} vaše buňky! Většina buněk se inkubuje při teplotě 37 °C, ale například některé hmyzí buňky vyžadují nižší teplotu.

Proč je rozmrazování pro buňky stresující?

Proces rozmrazování vystavuje buňky potenciálně škodlivým změnám prostředí, jak je popsáno níže:

• Změny teploty: Při přechodu z kryogenních teplot na vyšší teploty může dojít k poškození buněk. Teplotní šok během rozmrazování může poškodit membrány, enzymy a další buňky.
• Osmotické změny: Kolísání osmotického tlaku během rozmrazování může poškodit buněčnou membránu a další struktury. Do buněk, které byly kryokonzervovány pomocí DMSO nebo glycerolu, se mohou dostat toxické látky.
• Odstranění kryoprotektiva: Kryoprotektiva se přidávají do buněk před zmrazením, aby se zabránilo tvorbě ledových krystalů, ale pokud se po rozmrazení neodstraní, jsou toxická.
• Změny pH: Změny pH během rozmrazování mohou buňky stresovat. Změny teploty nebo uvolňování metabolických odpadních produktů mohou způsobit změny pH.
• Mechanický stres: Při rozmrazování se buňky pipetují a odstřeďují, což může vést k mechanickému namáhání. Ten může poškodit buňky a snížit jejich životaschopnost.

Rozmrazování může buňky stresovat a poškodit jejich životaschopnost a funkci. Kryoprotektiva a správný protokol rozmrazování mohou toto poškození minimalizovat.

5 tipů pro úspěšné rozmrazování a oživování buněk

1. Používejte protokol pro rozmrazování buněk specifický pro typ rozmrazovaných buněk, například techniku pomalého rozmrazování pro nádorové a kmenové buňky.
2. Omezte vystavení vysokým teplotám a prodlouženou dobu rozmrazování, abyste minimalizovali riziko poškození buněk.
3. Během rozmrazování a oživování zacházejte s buňkami opatrně, aby nedošlo k jejich poškození.
4. Před použitím buněk v experimentech zkontrolujte, zda jsou poškozené a životaschopné, a sledujte jejich růst.

Dodržujte doporučené protokoly a pokyny pro rozmrazování a oživování kryokonzervovaných buněk.