Wiederbelebung von Zellen nach Kryokonservierung

Zellen, Gewebe und sogar einige Tierarten können über einen längeren Zeitraum gelagert und dann für weitere Untersuchungen wiedergewonnen werden. Dieser Artikel befasst sich mit den verschiedenen Verfahren zum Auftauen von Zellen bei der Kryokonservierung und gibt Hinweise zur Wiederbelebung und Gewährleistung der Lebensfähigkeit der Zellen. Es ist jedoch wichtig, dass Sie die Anweisungen Ihres Zellkulturanbieters genau befolgen.

Wichtigste Erkenntnisse

• Das Auftauen von Zellen ist ein entscheidender Schritt im Kryokonservierungsprozess, bei dem die gefrorenen Zellen schrittweise auf Raumtemperatur erwärmt werden.
• Beim Auftauen von Krebs- und Stammzellen empfiehlt es sich, die Fläschchen langsam aufzutauen, da dies das Risiko einer Zellschädigung verringert.
• Während des Auftauprozesses sind die Auftaugeschwindigkeit, die Temperatur und die Einwirkung von Kryoprotektoren Faktoren, die zu Zellschäden führen können.
• Die Wiederbelebung von Zellen erfordert, dass sie mit den Nährstoffen und Mineralien versorgt werden, die sie für ihr Wachstum benötigen.
• Nach der Wiederbelebung der Zellen und vor ihrer Verwendung in Experimenten müssen die Zellen auf Schäden und Lebensfähigkeit geprüft sowie ihr Wachstum und ihre Vermehrung überwacht werden.
• Um ein erfolgreiches Auftauen und Wiederbeleben der Zellen zu gewährleisten, ist es wichtig, die empfohlenen Richtlinien und Protokolle einzuhalten, die Zellen sorgfältig zu behandeln und genaue Aufzeichnungen zu führen.

Auftauprotokoll

1. Tauen Sie die Zellen 1 - 2 Minuten lang in einem 37°C warmen Wasserbad auf, bis nur noch ein kleiner Eisklumpen im Kryovial vorhanden ist.
   • Von diesem Zeitpunkt an müssen alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.
2. Überführen Sie das Kryovial in einen sterilen Durchflussschrank.
3. Öffnen Sie das Fläschchen vorsichtig und verwenden Sie eine serologische 2-mL-Pipette, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen, indem Sie das Gesamtvolumen der Zelllösung messen. Entnehmen Sie dann 20 µL der Zellen zum Zählen als Aliquot.
4. Geben Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 8 ml Kulturmedium (Raumtemperatur) enthält.
5. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig.
6. Zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 300 x g und verwerfen Sie den Überstand.
   • Der Zentrifugationsschritt kann ausgelassen werden und die Zellen können sofort in eine Zellkulturflasche gegeben werden, aber stellen Sie sicher, dass Sie das Medium 24 Stunden später wechseln.
7. Die Zellen sofort in 10 ml frisches Zellkulturmedium (auf Raumtemperatur oder 37 °C im Brutschrank vorgewärmt) geben, um Wachstumsnährstoffe bereitzustellen und das Kryoprotektivum, wie z. B. DSMO, zu verdünnen. Als Kälteschutzmittel schützt DMSO die Zellen vor Gefrierschäden, indem es die Bildung von Eiskristallen verhindert, kann aber in hohen Konzentrationen für die Zellen giftig sein. Zwei T25-Zellkulturflaschen sollten mit Zellen gefüllt werden.
8. Stellen Sie die Zellen in einen Inkubator und wechseln Sie am nächsten Tag das Medium.
9. Fahren Sie mit der Inkubation der belebten Zellen fort, wie es für diese spezielle Zelllinie vorgeschrieben ist.
10. Lassen Sie die aufgetauten Zellen vor der Durchführung Ihrer Experimente im Kulturmedium ruhen, damit sich die Zellen von dem Auftaustress erholen können. Überprüfen Sie außerdem die Zellen durch mikroskopische Beobachtung oder durch einen Lebensfähigkeitstest auf Schäden und Lebensfähigkeit und beobachten Sie das Wachstum der Zellen.

Hinweis: Vergessen Sie nicht, die für Ihre Zellen_geeignete Inkubationstemperatur und_CO2 einzustellen! Die meisten Zellen werden bei 37 °C bebrütet, aber einige Insektenzellen benötigen zum Beispiel niedrigere Temperaturen.

Warum ist das Auftauen stressig für die Zellen?

Beim Auftauen werden die Zellen potenziell schädlichen Umweltveränderungen ausgesetzt, die im Folgenden beschrieben werden:

• Temperaturveränderungen: Zellen können beim Übergang von kryogenen zu wärmeren Temperaturen geschädigt werden. Der Temperaturschock während des Auftauens kann Membranen, Enzyme und andere Zellen schädigen.
• Osmotische Veränderungen: Osmotische Druckschwankungen während des Auftauens können die Zellmembran und andere Strukturen schädigen. Toxische Substanzen können in Zellen eindringen, die mit DMSO oder Glycerin kryokonserviert wurden.
• Entfernung von Kryoprotektoren: Kryoprotektoren werden den Zellen vor dem Einfrieren zugesetzt, um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern, sie sind jedoch giftig, wenn sie nach dem Auftauen nicht entfernt werden.
• PH-Änderungen: pH-Änderungen während des Auftauens können die Zellen belasten. Temperaturänderungen oder die Freisetzung von Stoffwechselabfallprodukten können pH-Veränderungen verursachen.
• Mechanische Belastung: Da die Zellen während des Auftauens pipettiert und zentrifugiert werden, kann es zu mechanischem Stress kommen. Dies kann die Zellen schädigen und ihre Lebensfähigkeit verringern.

Das Auftauen kann Zellen stressen und ihre Lebensfähigkeit und Funktion beeinträchtigen. Kälteschutzmittel und ein gutes Auftauprotokoll können diese Schäden minimieren.

5 Tipps für erfolgreiches Auftauen und Wiederbeleben von Zellen

1. Verwenden Sie für das Auftauen von Zellen ein auf den jeweiligen Zelltyp abgestimmtes Protokoll, z. B. ein langsames Auftauprogramm für Krebs- und Stammzellen.
2. Verringern Sie die Exposition gegenüber hohen Temperaturen und die Dauer des Auftauprozesses, um das Risiko von Zellschäden zu minimieren.
3. Behandeln Sie die Zellen während des Auftauens und der Wiederbelebung vorsichtig, um Schäden zu vermeiden.
4. Überprüfen Sie die Zellen auf Schäden und Lebensfähigkeit und verfolgen Sie ihr Wachstum, bevor Sie sie in Experimenten verwenden.

Halten Sie sich an die empfohlenen Protokolle und Richtlinien für das Auftauen und Wiederbeleben von kryokonservierten Zellen.