Sejtek újraélesztése kriokonzerválás után

A sejtek, szövetek, sőt egyes fajok is tárolhatók hosszabb ideig, majd további tanulmányozás céljából visszanyerhetők. Ez a cikk a kriokonzerválás során a sejtek felolvasztására használt különböző eljárásokat tekinti át, és útmutatást ad a sejtek újraélesztéséhez és életképességének biztosításához. Fontos azonban, hogy szorosan kövesse a sejttenyésztő szolgáltatója által adott utasításokat.

A legfontosabb tudnivalók

• A sejtek felolvasztása a krioprezerválási folyamat egyik kulcsfontosságú lépése, amely a fagyasztott sejtek fokozatos felmelegítését jelenti szobahőmérsékletre.
• A rákos sejtek és őssejtek felolvasztásakor ajánlott az üvegeket lassan felolvasztani, mert ez csökkenti a sejtek károsodásának kockázatát.
• A kiolvasztás során a kiolvasztás sebessége, a hőmérséklet és a krioprotektánsnak való kitettség mind olyan tényezők, amelyek sejtkárosodást okozhatnak.
• A sejtek felélesztéséhez biztosítani kell számukra a növekedésükhöz szükséges tápanyagokat és ásványi anyagokat.
• A sejtek újraélesztése után és a kísérletekben való felhasználásuk előtt ellenőrizni kell a sejtek károsodását és életképességét, valamint nyomon kell követni növekedésüket és szaporodásukat.
• A sejtek sikeres felolvasztása és újraélesztése érdekében elengedhetetlen az ajánlott irányelvek és protokollok betartása, a sejtek gondos kezelése és a pontos nyilvántartás vezetése.

Kiolvasztási protokoll

1. Gyorsan olvassza fel a sejteket 37 °C-os vízfürdőben 1-2 percig, amíg csak egy kis jégcsomó marad a kriovialban.
   • Ettől kezdve minden eljárást aszeptikus körülmények között kell elvégezni.
2. Vigye át a kriovialitást egy fertőtlenített steril áramlási szekrénybe.
3. Óvatosan nyissa fel az üvegcsét, és egy 2 ml-es szerológiai pipetta segítségével határozza meg a sejtek teljes számát a sejtoldat teljes térfogatának mérésével. Ezután vegyen ki 20 µl sejtet aliquotként a számláláshoz.
4. Helyezze a sejtszuszpenziót egy 15 ml-es centrifugacsőbe, amely 8 ml táptalajt tartalmaz (szobahőmérsékleten).
5. Óvatosan szuszpendálja a sejteket.
6. Centrifugáljon 3 percig 300 x g-nél, és dobja el a felülúszót.
   • A centrifugálási lépés elhagyható, és a sejteket azonnal sejttenyésztő lombikba lehet helyezni, de 24 órával később mindenképpen cserélni kell a táptalajt.
7. A sejteket azonnal helyezze 10 ml friss (szobahőmérsékletre vagy 37 °C-ra előmelegített vagy inkubátorban 37 °C-ra melegített) sejttenyésztő táptalajba a növekedési tápanyagok biztosítása és a krioprotektáns, például a DSMO hígítása érdekében. A DMSO krioprotektánsként megvédi a sejteket a fagyasztás okozta károsodástól azáltal, hogy megakadályozza a jégkristályok kialakulását, de nagy koncentrációban mérgező lehet a sejtekre. Két T25-ös sejttenyésztő lombikot kell megtölteni sejtekkel.
8. Helyezze a sejteket inkubátorba, és másnap cserélje ki a tápfolyadékot.
9. Folytassa az újraélesztett sejtek inkubálását az adott sejtvonalra vonatkozó utasításoknak megfelelően.
10. A kísérletek elvégzése előtt hagyja a felolvasztott sejteket tápközegben regenerálódni, hogy a sejtek ki tudják hevíteni a felolvasztási stresszt. Ellenőrizze továbbá a sejtek károsodását és életképességét mikroszkópos megfigyeléssel vagy életképességi teszt elvégzésével, és kövesse nyomon a sejtek növekedését.

Megjegyzés: Ne felejtsen el utánanézni és beállítani a sejteknek_megfelelő inkubációs hőmérsékletet és_CO2-t ! A legtöbb sejtet 37 °C-on inkubáljuk, de egyes rovarsejtek például alacsonyabb hőmérsékletet igényelnek.

Miért stresszes a sejtek felolvasztása?

A kiolvasztás során a sejtek az alábbiakban leírt, potenciálisan káros környezeti változásoknak vannak kitéve:

• Hőmérsékletváltozások: A sejtek károsodhatnak a kriogén hőmérsékletről a melegebb hőmérsékletre való átmenet során. A kiolvasztás során fellépő hő sokk károsíthatja a membránokat, enzimeket és más sejteket.
• Ozmotikus változások: A kiolvasztás során fellépő ozmotikus nyomásingadozások károsíthatják a sejtmembránt és más struktúrákat. Toxikus anyagok kerülhetnek a DMSO-val vagy glicerinnel hibernált sejtekbe.
• A krioprotektáns eltávolítása: A krioprotektánsokat a fagyasztás előtt adják a sejtekhez, hogy megakadályozzák a jégkristályok kialakulását, de mérgezőek, ha a kiolvasztás után nem távolítják el őket.
• PH-változások: A felolvasztás során bekövetkező pH-változások stresszelhetik a sejteket. A hőmérsékletváltozás vagy a metabolikus salakanyagok felszabadulása okozhat pH-változást.
• Mechanikai stressz: Mivel a sejteket a kiolvasztás során pipettázzák és centrifugálják, mechanikai stressz léphet fel. Ez károsíthatja a sejteket és csökkentheti életképességüket.

A felolvasztás stresszt okozhat a sejteknek, és károsíthatja életképességüket és működésüket. A krioprotektánsok és a megfelelő kiolvasztási protokoll minimalizálhatja ezt a károsodást.

5 tipp a sejtek sikeres felolvasztásához és újraélesztéséhez

1. Használjon a sejtek felolvasztásához a felolvasztandó sejttípusra jellemző protokollt, például lassú felolvasztási technikát a rákos sejtek és őssejtek esetében.
2. A sejtkárosodás kockázatának minimalizálása érdekében csökkentse a magas hőmérsékletnek való kitettséget és a hosszú felolvasztási időt.
3. A kiolvasztás és az újraélesztés során a sejteket óvatosan kezelje a károsodás elkerülése érdekében.
4. A sejtek károsodását és életképességét ellenőrizze, és kísérleti felhasználásuk előtt kövesse nyomon a növekedésüket.

Tartsa be a kriokonzervált sejtek felolvasztására és újraélesztésére vonatkozó ajánlott protokollokat és irányelveket.