Publié : 2023 | Dernière révision : mai 2026

Réanimation des cellules après cryoconservation

Les cellules, les tissus et même certaines espèces peuvent être conservés pendant une longue période, puis récupérés en vue d’études ultérieures. Cet article passe en revue les différentes procédures utilisées pour décongeler les cellules cryoconservées et fournit des conseils pour les réanimer et garantir leur viabilité. Il est toutefois important de suivre scrupuleusement les instructions fournies par votre fournisseur de cultures cellulaires.

Points clés

• La décongélation des cellules est une étape cruciale du processus de cryoconservation, qui consiste à réchauffer progressivement les cellules congelées jusqu’à la température ambiante.
• Pour la décongélation des cellules cancéreuses et des cellules souches, il est recommandé de décongeler les flacons lentement, car cela réduit le risque de dommages cellulaires.
• Pendant la décongélation, la vitesse de décongélation, la température et l’exposition au cryoprotecteur sont autant de facteurs pouvant causer des dommages aux cellules.
• Pour réactiver les cellules, il faut leur fournir les nutriments et les minéraux dont elles ont besoin pour leur croissance.
• Après la réactivation des cellules et avant de les utiliser dans des expériences, il est nécessaire de vérifier si les cellules ont subi des dommages et d’évaluer leur viabilité, ainsi que de surveiller leur croissance et leur prolifération.
• Pour garantir le succès de la décongélation et de la réactivation des cellules, il est essentiel de respecter les lignes directrices et les protocoles recommandés, de manipuler les cellules avec soin et de tenir des registres précis.

Protocole de décongélation

1. Décongeler rapidement les cellules dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 à 2 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit morceau de glace dans le cryotube.
   • À partir de ce moment, toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions aseptiques.
2. Transférer le cryotube dans une hotte à flux laminaire stérile et désinfectée.
3. Ouvrez soigneusement le tube et utilisez une pipette sérologique de 2 mL pour déterminer le nombre total de cellules en mesurant le volume total de la solution cellulaire. Prélevez ensuite 20 µL de cellules pour les compter en aliquote.
4. Placer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 8 ml de milieu de culture (à température ambiante).
5. Remuer délicatement la suspension cellulaire.
6. Centrifuger pendant 3 minutes à 300 x g et jeter le surnageant.
   • L’étape de centrifugation peut être omise et les cellules peuvent être placées immédiatement dans un flacon de culture cellulaire, mais assurez-vous de changer le milieu 24 heures plus tard.
7. Placer immédiatement les cellules dans 10 ml de milieu de culture cellulaire frais (préalablement réchauffé à température ambiante ou à 37 °C dans un incubateur) afin de leur fournir des nutriments de croissance et de diluer le cryoprotecteur, tel que le DMSO. En tant que cryoprotecteur, le DMSO protège les cellules des dommages causés par la congélation en empêchant la formation de cristaux de glace, mais il peut être toxique pour les cellules à des concentrations élevées. Deux flacons de culture cellulaire T25 doivent être remplis de cellules.
8. Placez les cellules dans un incubateur et changez le milieu le lendemain.
9. Poursuivez l’incubation des cellules revitalisées conformément aux instructions propres à cette lignée cellulaire.
10. Avant de mener vos expériences, laissez les cellules décongelées se rétablir dans le milieu de culture afin qu’elles puissent se remettre du stress lié à la décongélation. Vérifiez également l’état des cellules et leur viabilité par observation au microscope ou en effectuant un test de viabilité, et surveillez leur croissance.

Remarque : N’oubliez pas de vérifier et de régler la température d’incubation et _{le taux de} CO_₂ adaptés à vos cellules! La plupart des cellules sont incubées à 37 °C, mais certaines cellules d’insectes, par exemple, nécessitent des températures plus basses.

Pourquoi la décongélation est-elle stressante pour les cellules?

Le processus de décongélation expose les cellules à des changements environnementaux potentiellement nuisibles, comme décrit ci-dessous :

• Changements de température : Les cellules peuvent subir des dommages lors du passage de températures cryogéniques à des températures plus élevées. Le choc thermique pendant la décongélation peut endommager les membranes, les enzymes et d’autres composants cellulaires.
• Changements osmotiques : Les fluctuations de la pression osmotique pendant la décongélation peuvent endommager la membrane cellulaire et d’autres structures. Des substances toxiques peuvent pénétrer dans les cellules qui ont été cryoconservées avec du DMSO ou du glycérol.
• Élimination du cryoprotecteur : Des cryoprotecteurs sont ajoutés aux cellules avant la congélation afin d’empêcher la formation de cristaux de glace, mais ils sont toxiques s’ils ne sont pas éliminés après la décongélation.
• Variations du pH : Les variations de pH pendant la décongélation peuvent causer un stress aux cellules. Les variations de température ou la libération de déchets métaboliques peuvent entraîner des variations de pH.
• Stress mécanique : Comme les cellules sont pipetées et centrifugées pendant la décongélation, un stress mécanique peut se produire. Cela peut endommager les cellules et réduire leur viabilité.

La décongélation peut causer un stress aux cellules et nuire à leur viabilité et à leur fonction. Les cryoprotecteurs et un bon protocole de décongélation peuvent minimiser ces dommages.

5 conseils pour réussir la décongélation et la réactivation des cellules

1. Utilisez un protocole de décongélation adapté au type de cellules à décongeler, comme une technique de décongélation lente pour les cellules cancéreuses et les cellules souches.
2. Réduisez l’exposition à des températures élevées et la durée de décongélation afin de minimiser le risque de dommages cellulaires.
3. Pendant la décongélation et la réactivation, manipulez les cellules avec soin pour éviter de les endommager.
4. Vérifiez l’état des cellules (dommages et viabilité) et suivez leur croissance avant de les utiliser dans des expériences.

Respectez les protocoles et les lignes directrices recommandés pour la décongélation et la réactivation des cellules cryoconservées.