Αναβίωση κυττάρων μετά από κρυοσυντήρηση

Κύτταρα, ιστοί, ακόμη και ορισμένα είδη μπορούν να αποθηκευτούν για παρατεταμένο χρονικό διάστημα και στη συνέχεια να ανακτηθούν για περαιτέρω μελέτη. Αυτό το άρθρο εξετάζει τις διάφορες διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για την απόψυξη των κυττάρων κατά την κρυοσυντήρηση και παρέχει οδηγίες για την αναβίωση και τη διασφάλιση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Ωστόσο, είναι σημαντικό να ακολουθείτε στενά τις οδηγίες που σας δίνει ο πάροχος κυτταροκαλλιέργειας.

Βασικά συμπεράσματα

• Η απόψυξη των κυττάρων είναι ένα κρίσιμο βήμα στη διαδικασία κρυοσυντήρησης, η οποία περιλαμβάνει τη σταδιακή θέρμανση των κατεψυγμένων κυττάρων σε θερμοκρασία δωματίου.
• Για την απόψυξη καρκινικών κυττάρων και βλαστικών κυττάρων συνιστάται η αργή απόψυξη των φιαλιδίων, διότι μειώνεται ο κίνδυνος βλάβης των κυττάρων.
• Κατά την απόψυξη, ο ρυθμός απόψυξης, η θερμοκρασία και η έκθεση σε κρυοπροστατευτικό είναι παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν βλάβη των κυττάρων.
• Η αναζωογόνηση των κυττάρων απαιτεί την παροχή σε αυτά των θρεπτικών συστατικών και ανόργανων συστατικών που χρειάζονται για την ανάπτυξή τους.
• Μετά την αναζωογόνηση των κυττάρων και πριν από τη χρήση τους σε πειράματα, είναι απαραίτητο να ελεγχθούν τα κύτταρα για βλάβη και βιωσιμότητα, καθώς και να παρακολουθείται η ανάπτυξη και ο πολλαπλασιασμός τους.
• Για να διασφαλιστεί η επιτυχής απόψυξη και αναζωογόνηση των κυττάρων, είναι σημαντικό να τηρούνται οι συνιστώμενες κατευθυντήριες γραμμές και πρωτόκολλα, να γίνεται προσεκτικός χειρισμός των κυττάρων και να τηρούνται ακριβή αρχεία.

Πρωτόκολλο απόψυξης

1. Ξεπαγώστε γρήγορα τα κύτταρα σε υδατόλουτρο 37°C για 1 - 2 λεπτά, έως ότου απομείνει μόνο μια μικρή μάζα πάγου στο κρυοφιαλίδιο.
   • Από αυτό το σημείο και μετά, όλες οι διαδικασίες πρέπει να εκτελούνται υπό ασηπτικές συνθήκες.
2. Μεταφέρετε το κρυοφιαλίδιο σε απολυμασμένο αποστειρωμένο θάλαμο ροής.
3. Ανοίξτε προσεκτικά το φιαλίδιο και χρησιμοποιήστε μια ορολογική πιπέτα 2 ml για να προσδιορίσετε τον συνολικό αριθμό κυττάρων μετρώντας τον συνολικό όγκο του κυτταρικού διαλύματος. Στη συνέχεια, αφαιρέστε 20 µL κυττάρων για καταμέτρηση ως aliquot.
4. Τοποθετήστε το εναιώρημα κυττάρων σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης των 15 ml που περιέχει 8 ml θρεπτικού μέσου καλλιέργειας (σε θερμοκρασία δωματίου).
5. Αιωρήστε τα κύτταρα με προσοχή.
6. Φυγοκεντρήστε για 3 λεπτά στα 300 x g και απορρίψτε το υπερκείμενο.
   • Το στάδιο της φυγοκέντρησης μπορεί να παραλειφθεί και τα κύτταρα να τοποθετηθούν αμέσως σε φιάλη κυτταροκαλλιέργειας, αλλά φροντίστε να αλλάξετε το μέσο 24 ώρες αργότερα.
7. Τοποθετήστε αμέσως τα κύτταρα σε 10 ml φρέσκου μέσου κυτταροκαλλιέργειας (προθερμασμένου σε θερμοκρασία δωματίου ή 37 °C σε επωαστήρα) για να παράσχετε θρεπτικά συστατικά ανάπτυξης και να αραιώσετε το κρυοπροστατευτικό, όπως το DSMO. Ως κρυοπροστατευτικό, το DMSO προστατεύει τα κύτταρα από βλάβες που προκαλούνται από την κατάψυξη, εμποδίζοντας το σχηματισμό κρυστάλλων πάγου, αλλά μπορεί να είναι τοξικό για τα κύτταρα σε υψηλές συγκεντρώσεις. Δύο φιάλες κυτταροκαλλιέργειας Τ25 πρέπει να γεμίσουν με κύτταρα.
8. Τοποθετήστε τα κύτταρα σε επωαστήρα και αλλάξτε το μέσο την επόμενη ημέρα.
9. Συνεχίστε την επώαση των αναζωογονημένων κυττάρων σύμφωνα με τις οδηγίες για τη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά.
10. Πριν από την εκτέλεση των πειραμάτων σας, αφήστε τα αποψυγμένα κύτταρα να ανακάμψουν σε μέσο καλλιέργειας, ώστε τα κύτταρα να ανακάμψουν από το στρες της απόψυξης. Επίσης, ελέγξτε τα κύτταρα για βλάβη και βιωσιμότητα με μικροσκοπική παρατήρηση ή με τη διεξαγωγή δοκιμής βιωσιμότητας και παρακολουθήστε την ανάπτυξη των κυττάρων.

Σημείωση: Μην ξεχάσετε να αναζητήσετε και να ρυθμίσετε τη θερμοκρασία επώασης και το_{CO2 που είναι κατάλληλα} για τα κύτταρά σας! Τα περισσότερα κύτταρα επωάζονται στους 37 °C, αλλά ορισμένα κύτταρα εντόμων, για παράδειγμα, απαιτούν χαμηλότερες θερμοκρασίες.

Γιατί η απόψυξη προκαλεί άγχος στα κύτταρα

Η διαδικασία απόψυξης εκθέτει τα κύτταρα σε δυνητικά επιβλαβείς περιβαλλοντικές αλλαγές, όπως περιγράφεται παρακάτω:

• Μεταβολές της θερμοκρασίας: Τα κύτταρα μπορεί να υποστούν βλάβη κατά τη μετάβαση από κρυογονικές σε θερμότερες θερμοκρασίες. Το θερμικό σοκ κατά την απόψυξη μπορεί να προκαλέσει βλάβη στις μεμβράνες, στα ένζυμα και σε άλλα κύτταρα.
• Οσμωτικές μεταβολές: Οι διακυμάνσεις της ωσμωτικής πίεσης κατά την απόψυξη μπορεί να προκαλέσουν βλάβη στην κυτταρική μεμβράνη και σε άλλες δομές. Τοξικές ουσίες μπορούν να εισέλθουν σε κύτταρα που έχουν κρυοσυντηρηθεί με DMSO ή γλυκερίνη.
• Αφαίρεση κρυοπροστατευτικού: Τα κρυοπροστατευτικά προστίθενται στα κύτταρα πριν από την κατάψυξη για να αποτρέψουν το σχηματισμό παγοκρυστάλλων, αλλά είναι τοξικά εάν δεν αφαιρεθούν μετά την απόψυξη.
• Μεταβολές στο pH: Οι μεταβολές του pH κατά την απόψυξη μπορούν να προκαλέσουν στρες στα κύτταρα. Οι μεταβολές της θερμοκρασίας ή η απελευθέρωση μεταβολικών αποβλήτων μπορεί να προκαλέσουν μεταβολές του pH.
• Μηχανική καταπόνηση: Καθώς τα κύτταρα διοχετεύονται με πιπέτα και φυγοκεντρίζονται κατά την απόψυξη, μπορεί να προκληθεί μηχανική καταπόνηση. Αυτό μπορεί να προκαλέσει βλάβη στα κύτταρα και να μειώσει τη βιωσιμότητά τους.

Η απόψυξη μπορεί να προκαλέσει στρες στα κύτταρα και να βλάψει τη βιωσιμότητα και τη λειτουργία τους. Τα κρυοπροστατευτικά και ένα καλό πρωτόκολλο απόψυξης μπορούν να ελαχιστοποιήσουν αυτή τη ζημία.

5 συμβουλές για επιτυχημένη απόψυξη και αναβίωση κυττάρων

1. Χρησιμοποιήστε ένα πρωτόκολλο απόψυξης κυττάρων ειδικό για τον τύπο των κυττάρων που αποψύχονται, όπως μια τεχνική αργής απόψυξης για καρκινικά κύτταρα και βλαστικά κύτταρα.
2. Μειώστε την έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες και τον παρατεταμένο χρόνο απόψυξης για να ελαχιστοποιήσετε τον κίνδυνο βλάβης των κυττάρων.
3. Κατά τη διάρκεια της απόψυξης και της αναβίωσης, χειριστείτε τα κύτταρα με προσοχή για να αποφύγετε τη ζημιά.
4. Ελέγξτε τα κύτταρα για βλάβη και βιωσιμότητα και παρακολουθήστε την ανάπτυξή τους πριν τα χρησιμοποιήσετε σε πειράματα.

Τηρείτε τα συνιστώμενα πρωτόκολλα και τις κατευθυντήριες γραμμές για την απόψυξη και την αναβίωση κρυοσυντηρημένων κυττάρων.