Menghidupkan Kembali Sel Setelah Kriopreservasi

Sel, jaringan, dan bahkan beberapa spesies dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama dan kemudian dihidupkan kembali untuk penelitian lebih lanjut. Artikel ini membahas berbagai prosedur yang digunakan untuk mencairkan sel dalam kriopreservasi dan memberikan panduan untuk menghidupkan kembali dan memastikan kelangsungan hidup sel. Namun, penting untuk mengikuti petunjuk yang diberikan oleh penyedia kultur sel Anda.

Poin-poin Penting

• Mencairkan sel adalah langkah penting dalam proses kriopreservasi, yang melibatkan pemanasan sel beku secara bertahap hingga mencapai suhu kamar.
• Untuk mencairkan sel kanker dan sel punca, disarankan untuk mencairkan botol secara perlahan karena dapat mengurangi risiko kerusakan sel.
• Selama pencairan, kecepatan pencairan, suhu, dan paparan krioprotektan merupakan faktor yang dapat menyebabkan kerusakan sel.
• Menghidupkan kembali sel memerlukan pemberian nutrisi dan mineral yang mereka butuhkan untuk pertumbuhan.
• Setelah menghidupkan kembali sel dan sebelum menggunakannya dalam eksperimen, sel perlu diperiksa untuk mengetahui kerusakan dan kelangsungan hidupnya, serta memantau pertumbuhan dan proliferasinya.
• Untuk memastikan keberhasilan pencairan dan penghidupan kembali sel, sangat penting untuk mematuhi pedoman dan protokol yang direkomendasikan, menangani sel dengan hati-hati, dan menyimpan catatan yang akurat.

Protokol pencairan

1. Cairkan sel dengan cepat dalam penangas air bersuhu 37°C selama 1 - 2 menit hingga hanya gumpalan es kecil yang tersisa di dalam kriovial.
   • Sejak saat itu, semua prosedur harus dilakukan dalam kondisi aseptik.
2. Pindahkan kriovial ke dalam lemari alir steril yang telah disterilkan.
3. Buka botol dengan hati-hati dan gunakan pipet serologis 2 mL untuk menentukan jumlah total sel dengan mengukur volume total larutan sel. Kemudian, keluarkan 20 µL sel untuk dihitung sebagai alikuot.
4. Tempatkan suspensi sel dalam tabung sentrifugasi 15 ml yang berisi 8 ml media kultur (suhu kamar).
5. Suspensi sel dengan hati-hati.
6. Sentrifus selama 3 menit pada 300 x g dan buang supernatan.
   • Langkah sentrifugasi dapat dihilangkan dan sel ditempatkan dalam labu kultur sel dengan segera, tetapi pastikan untuk mengganti medium 24 jam kemudian.
7. Tempatkan sel dalam 10 ml medium kultur sel segar (yang telah dihangatkan sebelumnya hingga suhu kamar atau 37°C dalam inkubator) segera untuk memberikan nutrisi pertumbuhan dan mengencerkan krioprotektan, seperti DSMO. Sebagai krioprotektan, DMSO melindungi sel dari kerusakan yang disebabkan oleh pembekuan dengan mencegah pembentukan kristal es, tetapi dapat bersifat toksik bagi sel pada konsentrasi tinggi. Dua labu kultur sel T25 harus diisi dengan sel.
8. Tempatkan sel dalam inkubator dan ganti media keesokan harinya.
9. Lanjutkan inkubasi sel yang telah direvitalisasi seperti yang diinstruksikan untuk garis sel khusus ini.
10. Sebelum melakukan eksperimen, biarkan sel yang dicairkan pulih dalam media kultur sehingga sel dapat pulih dari tekanan pencairan. Selain itu, periksa sel untuk kerusakan dan viabilitas dengan pengamatan mikroskopis, atau dengan melakukan uji viabilitas, dan pantau pertumbuhan sel.

Catatan: Jangan lupa untuk mencari dan mengatur suhu inkubasi dan_{CO2 yang sesuai} untuk sel Anda! Sebagian besar sel diinkubasi pada suhu 37°C, tetapi beberapa sel serangga, misalnya, membutuhkan suhu yang lebih rendah.

Mengapa proses pencairan dapat menyebabkan stres pada sel?

Proses pencairan membuat sel terpapar pada perubahan lingkungan yang berpotensi berbahaya seperti yang dijelaskan di bawah ini:

• Perubahan suhu: Sel dapat rusak selama transisi dari suhu kriogenik ke suhu yang lebih hangat. Guncangan termal selama proses pencairan dapat merusak membran, enzim, dan sel lainnya.
• Perubahan osmotik: Fluktuasi tekanan osmotik selama pencairan dapat merusak membran sel dan struktur lainnya. Zat beracun dapat masuk ke dalam sel yang telah dikriopreservasi dengan DMSO atau gliserol.
• Penghapusan krioprotektan: Krioprotektan ditambahkan ke dalam sel sebelum pembekuan untuk mencegah pembentukan kristal es, tetapi krioprotektan bersifat toksik jika tidak dihilangkan setelah pencairan.
• Perubahan pH: Perubahan pH selama pencairan dapat membuat sel stres. Perubahan suhu atau pelepasan produk limbah metabolisme dapat menyebabkan perubahan pH.
• Tekanan mekanis: Saat sel dipipet dan disentrifugasi selama pencairan, tekanan mekanis dapat terjadi. Hal ini dapat merusak sel dan mengurangi kelangsungan hidupnya.

Pencairan dapat membuat sel stres dan merusak kelangsungan hidup dan fungsinya. Krioprotektan dan protokol pencairan yang baik dapat meminimalkan kerusakan ini.

5 Tips untuk Mencairkan dan Menghidupkan Kembali Sel yang Berhasil

1. Gunakan protokol untuk mencairkan sel yang spesifik untuk jenis sel yang dicairkan, seperti teknik pencairan lambat untuk sel kanker dan sel punca.
2. Kurangi paparan suhu tinggi dan waktu pencairan yang lama untuk meminimalkan risiko kerusakan sel.
3. Selama pencairan dan penghidupan kembali, tangani sel dengan hati-hati untuk menghindari kerusakan.
4. Periksa sel untuk mengetahui kerusakan dan kelangsungan hidup serta melacak pertumbuhannya sebelum menggunakannya dalam eksperimen.

Patuhi protokol dan panduan yang direkomendasikan untuk mencairkan dan menghidupkan kembali sel kriopreservasi.