Ląstelių atgaivinimas po kriokonservavimo

Ląstelės, audiniai ir net kai kurių rūšių gyvūnai gali būti saugomi ilgesnį laiką, o vėliau atgaivinami tolesniems tyrimams. Šiame straipsnyje apžvelgiamos įvairios kriokonservavimo ląstelių atšildymo procedūros ir pateikiamos gairės, kaip atgaivinti ląsteles ir užtikrinti jų gyvybingumą. Tačiau svarbu atidžiai laikytis ląstelių kultūrų tiekėjo pateiktų instrukcijų.

Pagrindinės išvados

• Ląstelių atšildymas yra labai svarbus kriokonservavimo proceso etapas, kurio metu užšaldytos ląstelės palaipsniui sušildomos iki kambario temperatūros.
• Atšildant vėžio ląsteles ir kamienines ląsteles rekomenduojama buteliukus atšildyti lėtai, nes taip sumažinama ląstelių pažeidimo rizika.
• Atšildymo metu atšildymo greitis, temperatūra ir krioprotektoriaus poveikis yra veiksniai, galintys sukelti ląstelių pažeidimus.
• Norint atgaivinti ląsteles, reikia aprūpinti jas augimui reikalingomis maistinėmis medžiagomis ir mineralais.
• Atgaivinus ląsteles ir prieš naudojant jas eksperimentams, būtina patikrinti, ar ląstelės nėra pažeistos ir gyvybingos, taip pat stebėti jų augimą ir dauginimąsi.
• Norint užtikrinti sėkmingą ląstelių atšildymą ir atgaivinimą, būtina laikytis rekomenduojamų gairių ir protokolų, atsargiai elgtis su ląstelėmis ir vesti tikslius įrašus.

Atšildymo protokolas

1. Greitai atšildykite ląsteles 37 °C temperatūros vandens vonelėje 1 - 2 minutes, kol kriovialyje liks tik nedidelis ledo gabalėlis.
   • Nuo šio momento visos procedūros turi būti atliekamos aseptinėmis sąlygomis.
2. Perkelkite kriovialą į dezinfekuotą sterilią srauto spintą.
3. Atsargiai atidarykite buteliuką ir naudodami 2 ml serologinę pipetę nustatykite bendrą ląstelių skaičių, matuodami bendrą ląstelių tirpalo tūrį. Tada alikvotine dalimi paimkite 20 µL ląstelių skaičiavimui.
4. Įdėkite ląstelių suspensiją į 15 ml centrifugos mėgintuvėlį, kuriame yra 8 ml auginimo terpės (kambario temperatūros).
5. Atsargiai suspenduokite ląsteles.
6. Centrifuguokite 3 minutes 300 x g greičiu ir išmeskite supernatantą.
   • Centrifugavimo etapo galima neatlikti ir ląsteles iš karto perkelti į ląstelių kultūrų kolbą, tačiau po 24 valandų būtinai pakeiskite terpę.
7. Ląsteles iš karto įdėkite į 10 ml šviežios ląstelių kultūros terpės (iš anksto pašildytos iki kambario temperatūros arba 37 °C temperatūros inkubatoriuje), kad gautumėte augimo maistinių medžiagų ir atskiestumėte krioprotektorių, pavyzdžiui, DSMO. Kaip krioprotektorius, DSMO apsaugo ląsteles nuo užšaldymo padarytos žalos, neleisdamas susidaryti ledo kristalams, tačiau didelėmis koncentracijomis jis gali būti toksiškas ląstelėms. Dvi T25 ląstelių kultūrų kolbos turėtų būti pripildytos ląstelių.
8. Įdėkite ląsteles į inkubatorių ir kitą dieną pakeiskite terpę.
9. Toliau inkubuokite atgaivintas ląsteles, kaip nurodyta šiai konkrečiai ląstelių linijai.
10. Prieš atlikdami eksperimentus, leiskite atšildytoms ląstelėms atsigauti mitybinėje terpėje, kad ląstelės atsigautų nuo atšildymo streso. Taip pat patikrinkite, ar ląstelės nepažeistos ir gyvybingos, stebėdami mikroskopu arba atlikdami gyvybingumo testą, ir stebėkite ląstelių augimą.

Pastaba: nepamirškite išsiaiškinti ir nustatyti jūsų ląstelėms_tinkamos inkubavimo temperatūros ir_CO2 ! Dauguma ląstelių inkubuojamos 37 °C temperatūroje, tačiau kai kurioms, pavyzdžiui, vabzdžių ląstelėms reikia žemesnės temperatūros.

Kodėl atšildymas kelia stresą ląstelėms?

Atšildymo metu ląstelės patiria galimai žalingus aplinkos pokyčius, kaip aprašyta toliau:

• Temperatūros pokyčiai: Ląstelės gali būti pažeistos pereinant iš kriogeninės į šiltesnę temperatūrą. Terminis šokas atšildymo metu gali pažeisti membranas, fermentus ir kitas ląsteles.
• Osmosiniai pokyčiai: Osmosinio slėgio svyravimai atšildymo metu gali pažeisti ląstelių membraną ir kitas struktūras. Toksinės medžiagos gali patekti į ląsteles, kurios buvo kriokonservuotos su DMSO arba gliceroliu.
• Krioprotektoriaus pašalinimas: Krioprotektorių dedama į ląsteles prieš užšaldymą, kad nesusidarytų ledo kristalų, tačiau jie yra toksiški, jei nepašalinami po atšildymo.
• PH pokyčiai: atšildymo metu vykstantys pH pokyčiai gali sukelti stresą ląstelėms. Temperatūros pokyčiai arba medžiagų apykaitos produktų išsiskyrimas gali sukelti pH pokyčius.
• Mechaninis stresas: Atšildymo metu ląstelės pipetuojamos ir centrifuguojamos, todėl gali atsirasti mechaninis poveikis. Tai gali pažeisti ląsteles ir sumažinti jų gyvybingumą.

Atšildymas gali sukelti stresą ląstelėms ir pakenkti jų gyvybingumui bei funkcijoms. Krioprotektoriai ir tinkamas atšildymo protokolas gali sumažinti šią žalą.

5 patarimai, kaip sėkmingai atšildyti ir atgaivinti ląsteles

1. Naudokite ląstelių atšildymo protokolą, būdingą atšildomų ląstelių tipui, pavyzdžiui, lėtą atšildymo metodą vėžio ląstelėms ir kamieninėms ląstelėms.
2. Sumažinkite aukštą temperatūrą ir ilgesnį atšildymo laiką, kad sumažintumėte ląstelių pažeidimo riziką.
3. Atšildymo ir atgaivinimo metu su ląstelėmis elkitės atsargiai, kad jos nebūtų pažeistos.
4. Prieš naudodami ląsteles eksperimentams, apžiūrėkite, ar jos nepažeistos ir gyvybingos, ir stebėkite jų augimą.

Laikykitės rekomenduojamų kriokonservuotų ląstelių atšildymo ir atgaivinimo protokolų ir rekomendacijų.