發佈日期：2023年 | 最後審閱日期：2026年5月

冷凍保存後細胞的復甦

細胞、組織，甚至某些物種均可長期儲存，並於日後取出進行進一步研究。本文探討冷凍保存中用於解凍細胞的各種程序，並針對細胞的復甦及確保其存活能力提供指引。然而，務必嚴格遵循您的細胞培養供應商所提供的指示。

重點摘要

• 細胞解凍是冷凍保存過程中至關重要的一步，其程序包含將冷凍細胞逐步加熱至室溫。
• 針對癌細胞與幹細胞的解凍，建議以緩慢速度進行，以降低細胞受損的風險。
• 在解凍過程中，解凍速率、溫度以及接觸冷凍保護劑的時間長短，都是可能導致細胞受損的因素。
• 要使細胞恢復活性，必須提供其生長所需的營養物質和礦物質。
• 在細胞恢復活性後、用於實驗之前，必須檢查細胞是否受損及存活率，並監測其生長與增殖狀況。
• 為確保細胞解凍與復甦成功，必須遵循建議的指引與操作規範、謹慎處理細胞，並維持準確的紀錄。

解凍程序

1. 將細胞置於 37°C 水浴中快速解凍 1 至 2 分鐘，直到冷凍管中僅剩一小塊冰塊為止。
   • 從此時起，所有操作均須在無菌條件下進行。
2. 將冷凍管移至經消毒的無菌氣流櫃中。
3. 小心地打開試管，並使用 2 mL 血清移液管測量細胞溶液的總體積，以確定細胞總數。然後，取出 20 µL 細胞作為分樣進行計數。
4. 將細胞懸浮液放入裝有 8 毫升培養基（室溫）的 15 毫升離心管中。
5. 小心地將細胞懸浮。
6. 以 300 x g 離心 3 分鐘，並棄去上清液。
   • 可省略離心步驟，將細胞立即置於細胞培養瓶中，但務必於 24 小時後更換培養基。
7. 立即將細胞置於 10 毫升新鮮的細胞培養基中（預先加熱至室溫或在培養箱中加熱至 37 °C），以提供生長營養並稀釋 DSMO 等冷凍保護劑。 作為冷凍保護劑，DMSO 透過防止冰晶形成來保護細胞免受冷凍造成的損傷，但高濃度的 DMSO 可能會對細胞產生毒性。應將細胞填入兩個 T25 細胞培養瓶中。
8. 將細胞置於培養箱中，並於隔天更換培養基。
9. 按照該特定細胞系的指示，繼續培養復甦後的細胞。
10. 在進行實驗之前，請讓解凍後的細胞在培養基中恢復，以便細胞從解凍壓力中恢復過來。此外，請透過顯微鏡觀察或進行存活率測試，檢查細胞是否受損及存活狀況，並監測細胞的生長情況。

注意：請務必查閱並設定適合您細胞的培養溫度與_二氧化碳濃度！大多數細胞在 37 °C 下培養，但某些昆蟲細胞則需要較低的溫度。

為何解凍會對細胞造成壓力？

解凍過程會使細胞暴露於以下所述的潛在有害環境變化中：

• 溫度變化：細胞在從低溫轉向較高溫度時可能受到損傷。解凍過程中的熱衝擊會損害細胞膜、酶及其他細胞結構。
• 滲透壓變化：解凍過程中的滲透壓波動可能損傷細胞膜及其他結構。若細胞曾使用二甲基亞砜（DMSO）或甘油進行冷凍保存，有毒物質可能滲入細胞內。
• 去除冷凍保護劑：冷凍保護劑是在冷凍前添加至細胞中以防止冰晶形成，但若在解凍後未予去除，則會產生毒性。
• pH 值變化：解凍過程中的 pH 值變化會對細胞造成壓力。溫度變化或代謝廢物的釋放都可能導致 pH 值變化。
• 機械應力：解凍過程中，細胞在移液和離心時可能受到機械應力，這可能損傷細胞並降低其存活率。

解凍過程可能對細胞造成壓力，並損害其存活率與功能。透過適當的冷凍保護劑及完善的解凍流程，可將此類損害降至最低。

成功解凍與恢復細胞活力的 5 個要訣

1. 請採用針對特定細胞類型設計的解凍程序，例如對癌細胞和幹細胞應採用緩慢解凍技術。
2. 減少細胞暴露於高溫的狀況，並縮短解凍時間，以將細胞受損的風險降至最低。
3. 在解凍與復甦過程中，應謹慎處理細胞，以避免造成損傷。
4. 在將細胞用於實驗前，應檢查細胞是否受損及存活率，並追蹤其生長狀況。

請嚴格遵循冷凍保存細胞解凍與復活的建議操作流程及指引。