Genoplivning af celler efter kryopræservering

Celler, væv og endda nogle arter kan opbevares i en længere periode og derefter udvindes til videre studier. Denne artikel ser på de forskellige procedurer, der anvendes til optøning af celler i kryopræservering, og giver vejledning i genoplivning og sikring af cellernes levedygtighed. Det er dog vigtigt nøje at følge instruktionerne fra din leverandør af cellekulturer.

Det vigtigste at tage med

• Optøning af celler er et afgørende trin i kryopræserveringsprocessen, som indebærer gradvis opvarmning af frosne celler til stuetemperatur.
• Ved optøning af kræftceller og stamceller anbefales det at optø flaskerne langsomt, fordi det reducerer risikoen for celleskader.
• Under optøningen er optøningshastighed, temperatur og eksponering for kryobeskyttelsesmiddel alle faktorer, der kan forårsage celleskader.
• Genoplivning af celler kræver, at de får de næringsstoffer og mineraler, de har brug for til vækst.
• Efter genoplivning af celler og før de bruges i eksperimenter, er det nødvendigt at kontrollere cellerne for skader og levedygtighed samt at overvåge deres vækst og spredning.
• For at sikre en vellykket optøning og genoplivning af celler er det vigtigt at følge de anbefalede retningslinjer og protokoller, håndtere cellerne med omhu og føre nøjagtige optegnelser.

Protokol for optøning

1. Optø cellerne hurtigt i et 37 °C varmt vandbad i 1-2 minutter, indtil der kun er en lille isklump tilbage i kryovialet.
   • Fra dette tidspunkt skal alle procedurer udføres under aseptiske forhold.
2. Overfør kryovialet til et desinficeret sterilt flowskab.
3. Åbn forsigtigt hætteglasset, og brug en 2 ml serologisk pipette til at bestemme det samlede antal celler ved at måle det samlede volumen af celleopløsningen. Fjern derefter 20 µL celler til optælling som en alikvot.
4. Anbring cellesuspensionen i et 15 ml centrifugerør, der indeholder 8 ml dyrkningsmedium (stuetemperatur).
5. Suspender cellerne med forsigtighed.
6. Centrifugér i 3 minutter ved 300 x g, og kassér supernatanten.
   • Centrifugeringstrinnet kan udelades, og cellerne kan placeres i en celledyrkningskolbe med det samme, men sørg for at skifte medium 24 timer senere.
7. Anbring straks cellerne i 10 ml frisk cellekulturmedium (forvarmet til stuetemperatur eller 37 °C i en inkubator) for at tilføre vækstnæringsstoffer og fortynde kryobeskyttelsesmidlet, såsom DSMO. Som kryobeskyttelsesmiddel beskytter DMSO cellerne mod skader forårsaget af frysning ved at forhindre dannelsen af iskrystaller, men det kan være giftigt for cellerne i høje koncentrationer. To T25-cellekulturkolber skal fyldes med celler.
8. Anbring cellerne i en inkubator, og skift mediet næste dag.
9. Fortsæt med at inkubere de revitaliserede celler som anvist for netop denne cellelinje.
10. Før du udfører dine eksperimenter, skal du lade de optøede celler komme sig i kulturmediet, så cellerne kan komme sig over optøningsstresset. Tjek også cellerne for skader og levedygtighed ved mikroskopisk observation eller ved at udføre en levedygtighedstest, og overvåg cellernes vækst.

Bemærk: Glem ikke at slå op og indstille den inkubationstemperatur og_CO2 , der passer til dine celler! De fleste celler inkuberes ved 37 °C, men nogle insektceller kræver f.eks. lavere temperaturer.

Hvorfor er optøning stressende for cellerne?

Optøningsprocessen udsætter cellerne for potentielt skadelige miljøændringer som beskrevet nedenfor:

• Temperaturændringer: Celler kan blive beskadiget under overgangen fra kryogene til varmere temperaturer. Termisk chok under optøning kan beskadige membraner, enzymer og andre celler.
• Osmotiske ændringer: Udsving i det osmotiske tryk under optøning kan beskadige cellemembranen og andre strukturer. Giftige stoffer kan trænge ind i celler, der er blevet kryopræserveret med DMSO eller glycerol.
• Fjernelse af kryobeskyttelsesmiddel: Kryobeskyttelsesmidler tilsættes cellerne før nedfrysning for at forhindre dannelse af iskrystaller, men de er giftige, hvis de ikke fjernes efter optøning.
• Ændringeri pH: pH -ændringer under optøning kan stresse cellerne. Temperaturændringer eller frigivelse af metaboliske affaldsprodukter kan forårsage pH-ændringer.
• Mekanisk stress: Når cellerne pipetteres og centrifugeres under optøningen, kan der opstå mekanisk stress. Det kan beskadige cellerne og reducere deres levedygtighed.

Optøning kan stresse cellerne og skade deres levedygtighed og funktion. Kryobeskyttende midler og en god optøningsprotokol kan minimere denne skade.

5 tips til vellykket optøning og genoplivning af celler

1. Brug en protokol til optøning af celler, der er specifik for den type celler, der skal optøs, f.eks. en langsom optøningsteknik til kræftceller og stamceller.
2. Reducer eksponering for høje temperaturer og forlænget optøningstid for at minimere risikoen for celleskader.
3. Under optøning og genoplivning skal cellerne håndteres forsigtigt for at undgå skader.
4. Undersøg cellerne for skader og levedygtighed, og følg deres vækst, før du bruger dem i eksperimenter.

Hold dig til de anbefalede protokoller og retningslinjer for optøning og genoplivning af kryopræserverede celler.