Kriyoprezervasyon Sonrası Hücrelerin Canlandırılması

Hücreler, dokular ve hatta bazı türler uzun bir süre boyunca saklanabilir ve daha sonra daha ileri çalışmalar için geri kazanılabilir. Bu makale, kriyoprezervasyonda hücrelerin çözülmesi için kullanılan çeşitli prosedürleri incelemekte ve hücrelerin canlandırılması ve canlılığının sağlanması için rehberlik sağlamaktadır. Ancak, hücre kültürü sağlayıcınız tarafından verilen talimatları yakından takip etmeniz önemlidir.

Temel Çıkarımlar

• Hücrelerin çözülmesi, dondurulmuş hücrelerin kademeli olarak oda sıcaklığına ısıtılmasını içeren kriyoprezervasyon sürecinde çok önemli bir adımdır.
• Kanser hücreleri ve kök hücrelerin çözdürülmesi için şişelerin yavaşça çözdürülmesi tavsiye edilir çünkü bu hücre hasarı riskini azaltır.
• Çözdürme sırasında, çözdürme hızı, sıcaklık ve kriyoprotektana maruz kalma, hücre hasarına neden olabilecek faktörlerdir.
• Hücrelerin canlandırılması, onlara büyümeleri için ihtiyaç duydukları besin ve minerallerin sağlanmasını gerektirir.
• Hücreleri canlandırdıktan sonra ve deneylerde kullanmadan önce, hücreleri hasar ve canlılık açısından kontrol etmenin yanı sıra büyümelerini ve çoğalmalarını izlemek gerekir.
• Hücrelerin başarılı bir şekilde çözülmesini ve canlandırılmasını sağlamak için önerilen yönergelere ve protokollere uymak, hücreleri özenle kullanmak ve doğru kayıtlar tutmak çok önemlidir.

Çözdürme protokolü

1. Hücreleri 37°C su banyosunda 1 - 2 dakika boyunca kriyoviyalde sadece küçük bir buz kümesi kalana kadar hızla çözün.
   • Bu noktadan itibaren, tüm prosedürler aseptik koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
2. Kriyoviali sterilize edilmiş steril bir akış kabinine aktarın.
3. Flakonu dikkatlice açın ve hücre solüsyonunun toplam hacmini ölçerek toplam hücre sayısını belirlemek için 2 mL'lik bir serolojik pipet kullanın. Ardından, sayım için 20 µL hücreyi alikot olarak alın.
4. Hücre süspansiyonunu 8 ml kültür ortamı (oda sıcaklığı) içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
5. Hücreleri dikkatle süspanse edin.
6. 300 x g'de 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
   • Santrifüjleme adımı atlanabilir ve hücreler hemen bir hücre kültürü şişesine yerleştirilebilir, ancak 24 saat sonra ortamı değiştirdiğinizden emin olun.
7. Büyüme besinleri sağlamak ve DSMO gibi kriyoprotektanı seyreltmek için hücreleri hemen 10 ml taze hücre kültürü ortamına (önceden oda sıcaklığına veya inkübatörde 37 °C'ye ısıtılmış) yerleştirin. Bir kriyoprotektan olarak DMSO, buz kristallerinin oluşumunu önleyerek hücreleri donmanın neden olduğu hasardan korur, ancak yüksek konsantrasyonlarda hücreler için toksik olabilir. İki adet T25 hücre kültürü şişesi hücrelerle doldurulmalıdır.
8. Hücreleri bir inkübatöre yerleştirin ve ertesi gün ortamı değiştirin.
9. Canlandırılmış hücreleri bu özel hücre hattı için belirtildiği şekilde inkübe etmeye devam edin.
10. Deneylerinizi gerçekleştirmeden önce, hücrelerin çözülme stresinden kurtulabilmesi için çözülmüş hücrelerin kültür ortamında toparlanmasına izin verin. Ayrıca, mikroskobik gözlemle veya bir canlılık testi yaparak hücrelerde hasar ve canlılık olup olmadığını kontrol edin ve hücrelerin büyümesini izleyin.

Not: Hücrelerinize_uygun inkübasyon sıcaklığını ve_CO2' yi araştırmayı ve ayarlamayı unutmayın! Çoğu hücre 37 °C'de inkübe edilir ancak örneğin bazı böcek hücreleri daha düşük sıcaklıklara ihtiyaç duyar.

Çözdürme işlemi hücreler için neden streslidir?

Çözdürme işlemi, hücreleri aşağıda açıklandığı gibi potansiyel olarak zararlı çevresel değişikliklere maruz bırakır:

• Sıcaklık değişiklikleri: Hücreler kriyojenik sıcaklıktan daha sıcak sıcaklıklara geçiş sırasında hasar görebilir. Çözülme sırasındaki termal şok membranlara, enzimlere ve diğer hücrelere zarar verebilir.
• Ozmotik değişiklikler: Çözülme sırasındaki ozmotik basınç dalgalanmaları hücre zarına ve diğer yapılara zarar verebilir. Toksik maddeler DMSO veya gliserol ile kriyoprezerve edilmiş hücrelere girebilir.
• Kriyoprotektanınçıkarılması: Kriyoprotektanlar buz kristali oluşumunu önlemek için dondurmadan önce hücrelere eklenir, ancak çözüldükten sonra çıkarılmazlarsa toksiktirler.
• PH'daki değişiklikler: Çözülme sırasındaki pH değişiklikleri hücreleri strese sokabilir. Sıcaklık değişiklikleri veya metabolik atık ürünlerin salınması pH değişikliklerine neden olabilir.
• Mekanik stres: Çözdürme sırasında hücreler pipetlendiğinden ve santrifüjlendiğinden mekanik stres oluşabilir. Bu durum hücrelere zarar verebilir ve canlılıklarını azaltabilir.

Çözdürme işlemi hücreleri strese sokabilir ve canlılıklarına ve işlevlerine zarar verebilir. Kriyoprotektanlar ve iyi bir çözdürme protokolü bu hasarı en aza indirebilir.

başarılı Hücre Çözdürme ve Canlandırma için 5 İpucu

1. Kanser hücreleri ve kök hücreler için yavaş çözdürme tekniği gibi çözdürülen hücre türüne özgü bir hücre çözdürme protokolü kullanın.
2. Hücre hasarı riskini en aza indirmek için yüksek sıcaklıklara maruz kalmayı ve uzun çözdürme süresini azaltın.
3. Çözdürme ve canlandırma sırasında, hasarı önlemek için hücreleri dikkatle tutun.
4. Hücreleri hasar ve canlılık açısından inceleyin ve deneylerde kullanmadan önce büyümelerini takip edin.

Dondurulmuş hücrelerin çözülmesi ve canlandırılması için önerilen protokollere ve yönergelere bağlı kalın.