การคัดกรอง CRISPR ในสายเซลล์: การวิเคราะห์การทำงานของยีนทั่วทั้งจีโนม

การคัดกรอง CRISPR ในสายเซลล์: การวิเคราะห์การทำงานของยีนทั่วทั้งจีโนม

เทคโนโลยี CRISPR-Cas9 ได้ปฏิวัติวงการจีโนมิกส์เชิงหน้าที่ โดยช่วยให้สามารถตรวจสอบการทำงานของยีนอย่างเป็นระบบทั่วทั้งจีโนมในเซลล์เพาะเลี้ยงที่ Cytion เราตระหนักดีว่าเซลล์และสายพันธุ์เซลล์ของเราทำหน้าที่เป็นแพลตฟอร์มอันทรงพลังสำหรับการประยุกต์ใช้การคัดกรองด้วย CRISPR เพื่อระบุยีนที่ควบคุมกระบวนการทางเซลล์ที่หลากหลาย ตั้งแต่การเพิ่มจำนวนเซลล์ไปจนถึงการดื้อยาต่อยาต้านจุลชีพ การคัดกรองแบบรวมกลุ่ม (Pooled CRISPR screens) จะนำไลบรารีที่มี RNA นำทาง (sgRNAs) หลายพันถึงหลายแสนตัวเข้าสู่ประชากรเซลล์ สร้างคอลเลกชันขนาดใหญ่ที่แต่ละเซลล์ได้รับการรบกวนทางพันธุกรรมที่แตกต่างกันโดยการใช้อิทธิพลที่เลือกสรรและติดตามว่า sgRNAs ใดเพิ่มขึ้นหรือลดลง นักวิจัยสามารถระบุยีนที่จำเป็นต่อการอยู่รอด ยีนที่ให้ความต้านทานต่อยา หรือยีนที่ควบคุมลักษณะทางฟีโนไทป์ใด ๆ ที่สามารถเลือกได้อย่างเป็นระบบ วิธีการทางจีโนมิกส์เชิงหน้าที่ที่ไม่ลำเอียงนี้ได้เร่งการค้นพบในชีววิทยามะเร็ง ภูมิคุ้มกันวิทยา โรคติดเชื้อ และชีววิทยาพื้นฐานของเซลล์ เปลี่ยนแปลงเซลล์เพาะเลี้ยงให้กลายเป็นเครื่องมือสำหรับการค้นพบทางชีววิทยาอย่างเป็นระบบ

ประเภทหน้าจอ	กลยุทธ์การคัดเลือก	ยีนที่ระบุแล้ว	การใช้งานหลัก
การคัดเลือกเชิงลบ (การหลุดออก)	การเพาะเลี้ยงอย่างต่อเนื่อง, ระบุ sgRNAs ที่หมดไป	ยีนที่จำเป็น, ยีนที่ส่งเสริมความสมบูรณ์	การระบุเป้าหมายการรักษา, ความพึ่งพาทางพันธุกรรม
การคัดเลือกเชิงบวก (การเพิ่มพูน)	การรักษาด้วยยา/สารพิษ, ระบุ sgRNAs ที่มีความเข้มข้นสูง	ยีนต้านทาน, ปัจจัยการอยู่รอด	กลไกของยา กลไกการดื้อยา
การคัดกรองโดยใช้ FACS	จัดเรียงเซลล์ตามการแสดงออกของเครื่องหมาย	ตัวควบคุมโปรตีน/เส้นทางเฉพาะ	การแยกเส้นทาง, การควบคุมตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ
การคัดกรองโดยใช้ภาพ	กล้องจุลทรรศน์อัตโนมัติพร้อมการวิเคราะห์	ตัวควบคุมสัณฐานวิทยา, ปัจจัยการกำหนดตำแหน่ง	ชีววิทยาของเซลล์, การทำงานของออร์แกเนลล์
การคัดกรองความเป็นพิษสังเคราะห์	ความจำเป็นเฉพาะบริบท	ปฏิสัมพันธ์ทางพันธุกรรม, การพึ่งพาแบบมีเงื่อนไข	มะเร็งวิทยาแบบแม่นยำ, การรักษาแบบผสมผสาน

การออกแบบและส่งมอบห้องสมุด CRISPR

ไลบรารี CRISPR ขนาดจีโนมประกอบด้วยลำดับ sgRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปยังยีนที่เข้ารหัสโปรตีนทุกตัวในจีโนม โดยทั่วไปจะมีไกด์ 4-10 ตัวต่อยีนเพื่อให้มั่นใจถึงความครอบคลุมที่แข็งแกร่งและคำนึงถึงประสิทธิภาพของไกด์ที่แตกต่างกันห้องสมุดจีโนมมนุษย์ทั่วทั้งจีโนมประกอบด้วยลำดับ sgRNA จำนวน 70,000-100,000 ลำดับ ในขณะที่ห้องสมุดที่มุ่งเน้นไปยังกลุ่มย่อย เช่น ไคเนส, ตัวควบคุมอีพิเจเนติก หรือเอนไซม์เมตาบอลิซึม ช่วยให้ครอบคลุมได้ลึกขึ้นด้วยโครงสร้างทั้งหมดที่น้อยลง คุณภาพของห้องสมุดมีผลกระทบอย่างมากต่อความสำเร็จของการคัดกรอง—ตัวนำทางต้องกระตุ้นการกำจัดเป้าหมายอย่างมีประสิทธิภาพในขณะที่หลีกเลี่ยงผลกระทบนอกเป้าหมายที่อาจทำให้การตีความสับสน

การส่งผ่านไวรัสเลนติวิรัสยังคงเป็นมาตรฐานสำหรับการนำไลบรารี sgRNA เข้าสู่ประชากรเซลล์ การรวมเลนติไวรัสที่มีไลบรารี sgRNA ครบถ้วนจะติดเชื้อเซลล์ที่ความเข้มข้นของการติดเชื้อต่ำ (MOI) โดยทั่วไปอยู่ที่ 0.3-0.5 เพื่อให้แน่ใจว่าเซลล์ที่ติดเชื้อส่วนใหญ่จะได้รับเพียงหนึ่งโครงสร้าง sgRNA เท่านั้น ข้อกำหนดในการรบกวนเซลล์เพียงครั้งเดียวนี้ช่วยป้องกันการรบกวนจากเซลล์ที่มีการลบยีนหลายตำแหน่งหลังจากการถ่ายโอนยีน การคัดเลือกด้วยยาปฏิชีวนะจะกำจัดเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อออกไป เหลือประชากรเซลล์ที่แต่ละเซลล์มีการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่กำหนดไว้ สำหรับสายเซลล์ Cytion ประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนจะแตกต่างกันไปตามชนิดของเซลล์—เซลล์แขวนลอยมักถ่ายโอนยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในขณะที่บางสายเซลล์ที่เกาะติดอาจต้องปรับค่าความเข้มข้นของไวรัส การใช้ polybrene และการฉีดไวรัสด้วยแรงเหวี่ยงให้เหมาะสม

การแทนค่าในห้องสมุด—จำนวนเซลล์ที่มี sgRNA แต่ละชนิด—มีผลกระทบอย่างมากต่อคุณภาพของการคัดกรองการคัดกรองทั่วทั้งจีโนมจำเป็นต้องรักษาจำนวนเซลล์ 500-1000 เซลล์ต่อ sgRNA ตลอดการทดลองเพื่อป้องกันการสูญเสียไกด์แบบสุ่มจากผลกระทบของการสุ่มตัวอย่างแบบสุ่ม สำหรับไลบรารี sgRNA ขนาด 100,000 รายการ จำเป็นต้องเริ่มต้นด้วยประชากรเซลล์ 50-100 ล้านเซลล์และรักษาจำนวนเซลล์ในสัดส่วนที่เหมาะสมผ่านการคัดเลือกและการผ่านรุ่น การมีตัวแทนที่ไม่เพียงพอจะก่อให้เกิดสัญญาณรบกวนที่บดบังผลลัพธ์ที่แท้จริงและสร้างผลบวกลวงจากการสูญเสียเซลล์แบบสุ่ม

การคัดกรองเชิงลบ: การระบุยีนที่จำเป็น

การคัดกรองแบบเลือกเชิงลบ (Negative selection screens) จะระบุยีนที่จำเป็นต่อการอยู่รอดหรือการเพิ่มจำนวนของเซลล์ภายใต้สภาวะเพาะเลี้ยงมาตรฐาน เซลล์จะถูกถ่ายโอนด้วยไลบรารี sgRNA จากนั้นคัดเลือกเซลล์ที่มีการรวมตัวของ sgRNA เข้าสู่จีโนม และนำไปเพาะเลี้ยงต่อเนื่องเป็นเวลา 2-4 สัปดาห์ โดยยังคงรักษาความหลากหลายของไลบรารีไว้ sgRNA ที่จับกับยีนจำเป็นจะลดลง เนื่องจากเซลล์ที่มียีนเหล่านั้นถูกทำลายหรือไม่สามารถเพิ่มจำนวนได้ เมื่อเปรียบเทียบปริมาณ sgRNA ที่เหลืออยู่ ณ จุดเวลาสุดท้ายกับประชากรเริ่มต้น (T0) จะสามารถระบุได้ว่ายีนใดมีความจำเป็นต่อความฟิตของเซลล์ภายใต้สภาวะทดลองดังกล่าว

การคัดกรองยีนที่จำเป็นสร้างแผนที่การพึ่งพาเฉพาะสายเซลล์ที่เผยให้เห็นช่องโหว่ที่สามารถใช้ประโยชน์ได้สำหรับการแทรกแซงทางบำบัดเซลล์มะเร็งมักพึ่งพาออนโคจีนหรือส่วนประกอบของเส้นทางสัญญาณที่ไม่จำเป็นต่อเซลล์ปกติ ซึ่งถือเป็นเป้าหมายในการรักษาที่มีศักยภาพ ตัวอย่างเช่นเซลล์ HeLaแสดงการพึ่งพาเฉพาะต่อยีนที่สนับสนุนการเพิ่มจำนวนอย่างรวดเร็วและการจัดการความไม่เสถียรของจีโนม โครงการ Cancer Dependency Map ได้ทำการคัดกรอง CRISPR ทั่วทั้งจีโนมในเซลล์มะเร็งหลายร้อยสายพันธุ์ โดยจัดทำรายการการพึ่งพาทางพันธุกรรมและเชื่อมโยงกับลักษณะทางจีโนมเพื่อทำนายจุดอ่อนเฉพาะของผู้ป่วย

การคัดกรองความจำเป็นเฉพาะบริบทเปรียบเทียบการพึ่งพาของยีนระหว่างสภาวะหรือสายเซลล์ที่แตกต่างกัน การดำเนินการคัดกรองแบบขนานในเซลล์ปกติเทียบกับเซลล์ที่เปลี่ยนแปลง หรือในเซลล์ที่มีพื้นฐานทางพันธุกรรมที่แตกต่างกัน จะช่วยระบุปฏิสัมพันธ์ที่เป็นอันตรายถึงชีวิตแบบสังเคราะห์ ซึ่งการสูญเสียยีนจะส่งผลถึงชีวิตเฉพาะในบริบทเฉพาะเท่านั้น การพึ่งพาเฉพาะบริบทเหล่านี้ให้ช่องทางการรักษา—การมุ่งเป้าที่ยีนที่จำเป็นในมะเร็งแต่ไม่จำเป็นในเนื้อเยื่อปกติจะช่วยลดความเป็นพิษสำหรับสายพันธุ์เซลล์ Cytion ที่มาจากแหล่งกำเนิดเนื้อเยื่อและสถานะการเปลี่ยนแปลงที่หลากหลาย การคัดกรอง CRISPR แบบเปรียบเทียบจะสร้างแผนที่โครงสร้างทางพันธุกรรมของความพึ่งพาของเซลล์

การคัดกรองโดยการคัดเลือกเชิงบวก: กลไกการต้านทานและการอยู่รอด

การคัดกรองด้วยการคัดเลือกเชิงบวกใช้แรงกดดันที่เลือกทำลายเซลล์ส่วนใหญ่ ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนของ sgRNAs ที่ช่วยให้เซลล์รอดชีวิตหรือต้านทานได้ การคัดกรองความต้านทานต่อยาจะทำการรักษาเซลล์ที่ติดเชื้อจากไลบรารีด้วยยาในความเข้มข้นที่ทำให้เซลล์ที่ไม่ถูกดัดแปลงตาย เซลล์ที่รอดชีวิตจะเพิ่มจำนวนของ sgRNAs ที่รบกวนเป้าหมายของยา เปิดใช้งานเส้นทางความต้านทาน หรือขัดขวางสัญญาณการตายของเซลล์ การระบุยีนเหล่านี้จะเผยให้เห็นกลไกการออกฤทธิ์ของยาและกลไกความต้านทานที่อาจเกิดขึ้นในทางคลินิก

การคัดกรองความต้านทานต่อสารพิษจะระบุยีนที่จำเป็นสำหรับการดูดซึม การกระตุ้น หรือความเป็นพิษต่อเซลล์ในขั้นตอนต่อไปของสารพิษ ตัวอย่างเช่น การคัดกรองด้วยสารพิษไดฟทีเรียจะเพิ่มปริมาณ sgRNAs ที่มุ่งเป้าไปที่ตัวรับสารพิษและส่วนประกอบของการขนส่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการเข้าสู่เซลล์ การคัดกรองความไวต่อเชื้อโรคจะนำเซลล์ไปสัมผัสกับไวรัสหรือสารพิษจากแบคทีเรีย เพื่อระบุปัจจัยของโฮสต์ที่จำเป็นสำหรับการติดเชื้อ การคัดกรองเหล่านี้ได้ทำแผนที่กลไกของเซลล์ที่ถูกใช้ประโยชน์โดยเชื้อโรค เผยให้เห็นเป้าหมายการรักษาที่เป็นไปได้เพื่อป้องกันการติดเชื้อ

การทดสอบการพึ่งพาปัจจัยการเจริญเติบโต (Growth factor independence screens) จะทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ในสภาวะที่มีซีรัมต่ำหรือการถอนปัจจัยการเจริญเติบโตเฉพาะเจาะจง เพื่อระบุยีนที่เมื่อถูกขัดขวางจะทำให้เซลล์สามารถเจริญเติบโตโดยไม่พึ่งพาปัจจัยการเจริญเติบโตได้ ยีนที่ถูกค้นพบเหล่านี้มักเป็นตัวต้านมะเร็ง (tumor suppressors) หรือตัวควบคุมเชิงลบของเส้นทางการส่งสัญญาณการเจริญเติบโต การเข้าใจเส้นทางการส่งสัญญาณที่ช่วยให้เซลล์สามารถพึ่งพาปัจจัยการเจริญเติบโตได้ จะช่วยให้เข้าใจกลไกการก้าวหน้าของมะเร็ง และระบุเป้าหมายที่เป็นไปได้สำหรับการรักษาแบบผสมผสานที่สามารถป้องกันการเกิดภาวะต้านทานได้

การคัดกรอง CRISPR ที่ใช้ FACS เป็นพื้นฐาน

การคัดแยกเซลล์ด้วยแสงเรืองแสง (Fluorescence-activated cell sorting) ช่วยให้สามารถคัดกรองยีนที่ควบคุมลักษณะทางฟีโนไทป์ที่สามารถวัดได้ด้วยแสงเรืองแสงได้ เซลล์ที่แสดงออกของรีพอร์ตเตอร์เรืองแสงภายใต้การควบคุมของเส้นทางที่น่าสนใจจะถูกถ่ายโอนด้วยไลบรารี sgRNA จากนั้นคัดแยกตามการแสดงออกของรีพอร์ตเตอร์ เซลล์ที่มีการแสดงออกของรีพอร์ตเตอร์สูงเทียบกับต่ำจะถูกเก็บแยกกัน และเปรียบเทียบปริมาณ sgRNA ระหว่างประชากรsgRNAs ที่มีความเข้มข้นสูงสามารถระบุตัวควบคุมเชิงบวก (มีความเข้มข้นสูงในกลุ่มที่มีการแสดงออกต่ำเมื่อถูกทำลาย) และตัวควบคุมเชิงลบ (มีความเข้มข้นสูงในกลุ่มที่มีการแสดงออกสูงเมื่อถูกทำลาย)

หน้าจอเครื่องหมายพื้นผิวจะคัดแยกเซลล์ตามการย้อมสีด้วยแอนติบอดีสำหรับโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์ หน้าจอเหล่านี้จะระบุตัวควบคุมการนำเสนอแอนติเจน ลิแกนด์ของจุดตรวจภูมิคุ้มกัน หรือโมเลกุลยึดเกาะ สำหรับการพัฒนาภูมิคุ้มกันบำบัด หน้าจอที่ใช้ FACS ได้ระบุยีนที่ควบคุมการแสดงออกของ PD-L1 ซึ่งเผยให้เห็นเส้นทางที่สามารถเป็นเป้าหมายได้ซึ่งอาจช่วยเพิ่มการตอบสนองต่อภูมิคุ้มกันบำบัด ความสามารถในการคัดแยกตามการแสดงออกของโปรตีนภายในเซลล์แทนที่จะเป็นการดัดแปลงตัวรายงาน ช่วยขยายขอบเขตการคัดกรองไปยังโปรตีนใดๆ ที่มีแอนติบอดีที่เหมาะสม

FACS แบบหลายพารามิเตอร์ช่วยให้สามารถแยกแยะลักษณะทางฟีโนไทป์ได้อย่างซับซ้อน การวัดตัวบ่งชี้หลายตัวพร้อมกันสามารถระบุยีนที่มีผลเฉพาะต่อประชากรเซลล์หรือสถานะเซลล์บางประเภทได้ ตัวอย่างเช่น การคัดแยกตามขนาดและความเป็นเม็ดรวมกับสารย้อมความมีชีวิตสามารถแยกเซลล์ที่กำลังตายแบบอะพอพโทซิสออกจากเซลล์ที่มีสุขภาพดี ทำให้สามารถคัดกรองตัวควบคุมกระบวนการอะพอพโทซิสได้ ข้อจำกัดหลักยังคงอยู่ที่ปริมาณงาน—การคัดกรองด้วย FACS ต้องการเซลล์มากกว่าการคัดเลือกแบบรอดชีวิตธรรมดา และเผชิญข้อจำกัดในทางปฏิบัติเกี่ยวกับจำนวนเซลล์ที่สามารถคัดแยกได้ ซึ่งอาจจำกัดขนาดของคลังเซลล์หรือการเป็นตัวแทนของเซลล์ในคลัง

การคัดกรองด้วย CRISPR ที่ใช้ภาพเป็นฐาน

กล้องจุลทรรศน์อัตโนมัติที่ผสานกับการวิเคราะห์ภาพช่วยให้สามารถคัดกรองลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่ไม่สามารถเข้าถึงได้ด้วย FACS เซลล์ที่ติดเชื้อด้วยไลบรารี sgRNA ที่จัดเรียงเป็นแถว (หนึ่งหรือสองสามตัวนำทางต่อหลุม) จะถูกตรึงและถ่ายภาพเพื่อสกัดคุณลักษณะทางสัณฐานวิทยาหลายร้อยต่อเซลล์ การเรียนรู้ของเครื่องจะจำแนกประเภทของลักษณะทางสัณฐานวิทยา ระบุตัวนำทางที่ก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่เป็นลักษณะเฉพาะ ต่างจากการคัดกรองแบบรวมกลุ่ม รูปแบบการจัดเรียงเป็นแถวจะรักษาการแยกพื้นที่ของการรบกวน ทำให้สามารถอ่านผลด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้

การคัดกรองลักษณะทางสัณฐานวิทยาของออร์แกเนลล์ช่วยระบุยีนที่ควบคุมเครือข่ายไมโตคอนเดรีย โครงสร้างของโกลจิ สัณฐานวิทยาของนิวเคลียส หรือการจัดระเบียบไซโตสเกเลตัน การคัดกรองเหล่านี้ได้เปิดเผยกลไกควบคุมคุณภาพที่รักษาการทำงานของออร์แกเนลล์และระบุยีนที่ประสานการทำงานของออร์แกเนลล์กับการก้าวหน้าของวัฏจักรเซลล์ สำหรับสายเซลล์ Cytion ที่มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่อธิบายไว้อย่างดี การคัดกรองโดยใช้ภาพสามารถระบุลักษณะทางฟีโนไทป์ที่ละเอียดอ่อนซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้จากการอ่านค่าอื่นๆ

การถ่ายภาพเซลล์แบบสดติดตามกระบวนการแบบไดนามิก เช่น การแบ่งเซลล์ การเคลื่อนที่ หรือการส่งสัญญาณแคลเซียมตลอดเวลา การถ่ายภาพแบบไทม์แลปส์ของเซลล์ที่ถูกทำให้กลายพันธุ์เป็นกลุ่มเผยให้เห็นยีนที่ควบคุมเวลาในการแบ่งเซลล์ การจัดแนวของเส้นใยไมโทติก หรือความเร็วและทิศทางการเคลื่อนที่ ความสมบูรณ์ของข้อมูลภาพมีต้นทุนคือปริมาณข้อมูลที่ลดลง—การทดสอบแบบเป็นกลุ่มตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงน้อยกว่าการทดสอบแบบรวมกลุ่ม แต่ห้องสมุดที่มุ่งเป้าไปที่ตระกูลยีนเฉพาะสามารถสร้างสมดุลระหว่างความครอบคลุมกับข้อจำกัดในทางปฏิบัติ

การวิเคราะห์และการตรวจสอบความถูกต้องของผลลัพธ์

หลังจากการคัดเลือกและการเก็บตัวอย่างแล้ว จะทำการสกัดDNAจีโนมและขยายบริเวณ sgRNA ด้วยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่มีอะแดปเตอร์สำหรับการหาลำดับพันธุกรรมด้วย การหาลำดับพันธุกรรมแบบลึกจะวัดปริมาณของแต่ละ sgRNA โดยสร้างจำนวนการอ่านที่สามารถเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างทดลองและตัวอย่างควบคุม เครื่องมือทางคอมพิวเตอร์เช่น MAGeCK, BAGEL หรือ JACKS จะประเมินการเพิ่มหรือการลดลงของปริมาณทางสถิติ โดยคำนึงถึงการทดสอบสมมติฐานหลายประการในหลายพันยีน

การตรวจจับที่มีความมั่นใจสูงแสดงผลที่สอดคล้องกันใน sgRNA หลายตัวที่แยกกันซึ่งกำหนดเป้าหมายไปยังยีนเดียวกัน ยีนที่มีเพียงหนึ่งหรือสองตัวชี้แนะที่แสดงผลน่าจะเป็นผลจากสิ่งประดิษฐ์นอกเป้าหมายมากกว่าการตรวจจับที่แท้จริง วิธีการทางสถิติจะรวบรวมหลักฐานจากตัวชี้แนะแต่ละตัวต่อยีน เพิ่มประสิทธิภาพในการตรวจจับผลบวกที่แท้จริงในขณะที่ลดการค้นพบเท็จจากเป้าหมายนอกตัวชี้แนะแต่ละตัว ตัวชี้แนะควบคุมที่กำหนดเป้าหมายไปยังยีนที่จำเป็นที่ทราบหรือตัวควบคุมที่ไม่กำหนดเป้าหมายจะช่วยยืนยันประสิทธิภาพของการคัดกรองและปรับเทียบเกณฑ์ทางสถิติ

การทดลองตรวจสอบความถูกต้องยืนยันผลการคัดกรองโดยใช้ sgRNAs อิสระหรือวิธีการกำจัดยีนแบบออร์โธโกนัล sgRNAs แต่ละตัวถูกโคลนและทดสอบในสายเซลล์ที่ใช้คัดกรอง และในสายเซลล์เพิ่มเติมหากเป็นไปได้เพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำและความสามารถในการนำไปใช้ทั่วไป การทดลองกู้คืนโดยการแสดงออกซ้ำของยีนเป้าหมายจาก cDNA ที่ไม่มีลำดับเป้าหมายของ sgRNA ยืนยันผลกระทบที่ตรงเป้าหมาย สำหรับการตรวจสอบความถูกต้องของเป้าหมายการรักษา การทดสอบผลการคัดกรองในพาเนลของสายเซลล์ Cytion ที่แสดงถึงพื้นฐานทางพันธุกรรมที่หลากหลายจะระบุการพึ่งพาที่นำไปใช้ได้กว้างขวางเทียบกับที่เฉพาะเจาะจงในบริบท

ตัวแปรและแนวทางการคัดกรองขั้นสูง

การคัดกรองด้วย CRISPRi และ CRISPRa ใช้ Cas9 ที่ไม่มีฤทธิ์ทางชีวเคมีซึ่งถูกเชื่อมต่อกับตัวกดหรือตัวกระตุ้นการถอดรหัส ทำให้สามารถลดหรือเพิ่มการแสดงออกของยีนได้อย่างย้อนกลับ แทนที่จะเป็นการกำจัดยีนอย่างถาวร วิธีการเหล่านี้หลีกเลี่ยงปัญหาจากการสูญเสียยีนทั้งหมด เลียนแบบการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนแทนการกลายพันธุ์เป็นศูนย์ และสามารถใช้คัดกรององค์ประกอบควบคุมที่ไม่เข้ารหัสโปรตีนได้ สำหรับยีนที่จำเป็นซึ่งการกำจัดยีนทำให้เกิดความตาย การลดการแสดงออกบางส่วนด้วย CRISPRi อาจเผยให้เห็นลักษณะทางฟีโนไทป์ที่ขึ้นกับขนาดยาและช่วงการรักษา

หน้าจอของตัวแก้ไขเบสแนะนำการกลายพันธุ์แบบจุดที่แม่นยำแทนการแทรก/การลบ ทำให้สามารถสร้างการกลายพันธุ์แบบระบบในโดเมนของโปรตีนหรือองค์ประกอบควบคุมได้ หน้าจอของไพรม์เอดิตติ้งสัญญาว่าจะมีความแม่นยำยิ่งขึ้น โดยแนะนำหรือแก้ไขการกลายพันธุ์เฉพาะเจาะจง หน้าจอรุ่นถัดไปเหล่านี้จะช่วยให้สามารถแยกแยะความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและหน้าที่ของโปรตีนได้อย่างเป็นระบบ และตรวจสอบตัวแปรที่เกี่ยวข้องกับโรคในระดับใหญ่

การคัดกรองแบบผสมผสานโดยใช้ห้องสมุด dual-sgRNA ทดสอบคู่ของยีนอย่างเป็นระบบเพื่อระบุปฏิสัมพันธ์ทางพันธุกรรม รวมถึงการเกิดพิษร่วมกัน การยับยั้ง และการซ้อนทับทางพันธุกรรม แม้จะมีความท้าทายทางเทคนิคเนื่องจากการเพิ่มขึ้นแบบปัจจัยในห้องสมุดที่ซับซ้อน การคัดกรองแบบผสมผสานสามารถทำแผนที่เครือข่ายทางพันธุกรรมและระบุกลยุทธ์การรักษาแบบผสมผสาน การคัดกรองแบบผสมผสานที่มุ่งเป้าไปที่คู่ของยีนที่สามารถพัฒนาเป็นยาได้เผยให้เห็นการรักษาแบบผสมผสานที่อาจป้องกันการดื้อยาหรือเพิ่มประสิทธิภาพเมื่อเทียบกับการรักษาด้วยยาเพียงตัวเดียว

การประยุกต์ใช้ในด้านการค้นคว้าและพัฒนายา

การคัดกรองด้วย CRISPR ช่วยเร่งการระบุเป้าหมายโดยการทดสอบอย่างเป็นระบบว่าเมื่อยีนใดถูกขัดขวางจะก่อให้เกิดลักษณะทางคลินิกที่ต้องการในการรักษา การคัดกรองการพึ่งพาของมะเร็งจะระบุยีนที่จำเป็นเฉพาะในเซลล์มะเร็ง ซึ่งอาจเป็นเป้าหมายในการรักษา การคัดกรองในเซลล์ที่มาจากผู้ป่วยหรือกลุ่มเซลล์ที่มีลักษณะทางพันธุกรรมเหมือนกันจะจัดลำดับเป้าหมายตามบริบททางพันธุกรรม ทำให้สามารถใช้วิธีการแพทย์แม่นยำที่จับคู่การรักษาเข้ากับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของผู้ป่วยได้

การศึกษาวิถีการออกฤทธิ์ของสารประกอบที่มีเป้าหมายไม่ทราบแน่ชัดใช้การคัดกรองด้วย CRISPR เพื่อระบุยีนที่ให้ความต้านทานหรือความไว หากการรบกวนยีนเฉพาะทำให้เกิดความต้านทานต่อสารประกอบ ยีนนั้นน่าจะเป็นรหัสสำหรับเป้าหมายหรือส่วนประกอบของวิถีที่จำเป็นสำหรับกิจกรรมของยา วิธีการนี้ได้อธิบายกลไกสำหรับทั้งการรักษาที่มีอยู่แล้วและใหม่ ช่วยเร่งการพัฒนาทางคลินิกและระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับการคัดเลือกผู้ป่วย

หน้าจอการทำนายกลไกการต้านทานจะทำการรักษาเซลล์ด้วยปริมาณยาที่ต่ำกว่าปริมาณที่ทำให้เสียชีวิตในระหว่างการคัดกรองด้วย CRISPR เพื่อระบุยีนที่เมื่อถูกทำลายแล้วจะก่อให้เกิดการต้านทาน ยีนเหล่านี้แสดงถึงกลไกที่อาจทำให้เนื้องอกหลบเลี่ยงการรักษาได้ ทำให้สามารถพัฒนาวิธีการรักษาแบบผสมผสานที่ปิดกั้นเส้นทางการต้านทานได้ สำหรับสายเซลล์ Cytion ที่จำลองชนิดของมะเร็งต่าง ๆ การคัดกรองการต้านทานช่วยให้การออกแบบการทดลองทางคลินิกและกลยุทธ์การติดตามผู้ป่วยมีประสิทธิภาพมากขึ้น

ความท้าทายและแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุด

ผลกระทบที่ไม่ตรงเป้าหมายยังคงเป็นข้อกังวลแม้จะมีการปรับปรุงอัลกอริทึมการออกแบบ sgRNA แล้วก็ตาม ไกด์บางตัวสามารถตัดตำแหน่งในจีโนมที่ไม่ต้องการซึ่งมีความคล้ายคลึงกับเป้าหมาย ส่งผลให้เกิดลักษณะทางฟีโนไทป์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการรบกวนยีนที่ตั้งใจไว้ การใช้ไกด์อิสระหลายตัวต่อยีนและการรวมข้อมูลทางสถิติจากไกด์ต่างๆ ช่วยลดปัญหานี้ได้ การตรวจสอบความถูกต้องของผลลัพธ์ที่ได้จากไกด์ที่ดีที่สุดด้วยวิธีออร์โธโกนัลช่วยยืนยันผลกระทบที่ตรงเป้าหมาย

การเคลื่อนที่ของการกำจัดที่ไม่สมบูรณ์หรือล่าช้าอาจส่งผลต่อผลการคัดกรอง sgRNAs บางชนิดตัดไม่สมบูรณ์ ทำให้เกิดการลดระดับบางส่วนแทนที่จะเป็นการกำจัดอย่างสมบูรณ์ ความเสถียรของโปรตีนหมายความว่า การกำจัดในระดับ DNA/RNA ต้องใช้เวลาให้โปรตีนที่มีอยู่สลายตัวก่อนที่ลักษณะทางฟีโนไทป์จะปรากฏ การคัดกรองต้องดำเนินการนานพอหลังจากการคัดเลือกเพื่อให้โปรตีนถูกกำจัดอย่างสมบูรณ์ โดยทั่วไปคือ 7-14 วัน ขึ้นอยู่กับครึ่งชีวิตของโปรตีนเป้าหมายและเวลาในการเพิ่มจำนวนของเซลล์

การควบคุมคุณภาพของหน้าจอรวมถึงการตรวจสอบการแสดงผลของไลบรารี การยืนยันกิจกรรมของ Cas9 และการตรวจสอบพฤติกรรมที่คาดหวังของตัวควบคุม การหาลำดับของประชากรเริ่มต้นยืนยันความซับซ้อนและการแสดงผลของไลบรารี ตัวควบคุมที่มุ่งเป้าไปที่ยีนที่จำเป็นที่รู้จักควรแสดงการลดลงอย่างชัดเจนในการคัดกรองเชิงลบ ในขณะที่ตัวควบคุมที่ไม่มุ่งเป้าไม่ควรเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ การเบี่ยงเบนจากพฤติกรรมที่คาดหวังของตัวควบคุมบ่งชี้ถึงปัญหาทางเทคนิคที่ต้องการการแก้ไขก่อนที่จะตีความผลการทดลอง

ทิศทางในอนาคตและการขยายการประยุกต์ใช้

Perturb-seq ผสานการคัดกรองด้วย CRISPR เข้ากับการหาลำดับ RNA ของเซลล์เดี่ยว เพื่อวิเคราะห์โปรไฟล์การตอบสนองของทรานสคริปโตมต่อการรบกวนทางพันธุกรรมนับพันพร้อมกัน วิธีการนี้ช่วยทำแผนที่ว่าการรบกวนของยีนแพร่กระจายผ่านเครือข่ายโมเลกุลอย่างไร เผยให้เห็นความสัมพันธ์ในการควบคุมและโครงสร้างของเส้นทางชีวภาพ สำหรับสายเซลล์ Cytion ชุดข้อมูล Perturb-seq ให้การวิเคราะห์ลักษณะการทำงานที่ครอบคลุม ซึ่งเสริมวิธีการคัดกรองแบบดั้งเดิม

การคัดกรอง CRISPR ในสิ่งมีชีวิตจริง (In vivo CRISPR screening) ขยายขอบเขตของการคัดกรองแบบรวมกลุ่มไปสู่แบบจำลองในสัตว์ทดลอง โดยสามารถระบุยีนที่ควบคุมการเจริญเติบโตของเนื้องอก การแพร่กระจาย หรือการตอบสนองต่อการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันในบริบทที่เกี่ยวข้องกับสรีรวิทยาของร่างกาย เซลล์ที่ติดเชื้อไลบรารีจะถูกปลูกถ่ายเข้าสู่หนูทดลอง และเก็บเกี่ยวเนื้องอกเพื่อวัดปริมาณ sgRNA ยีนที่พบเพิ่มขึ้นในเนื้องอกที่กำลังเจริญเติบโตเป็นตัวขับเคลื่อนสมรรถนะในสิ่งมีชีวิตจริง ซึ่งอาจถูกมองข้ามจากการคัดกรองในวัฒนธรรมเซลล์ วิธีการเหล่านี้ช่วยเชื่อมโยงระหว่างการศึกษาระดับสายพันธุ์เซลล์กับการแปลผลสู่การทดลองทางคลินิก

สำหรับ Cytion และชุมชนการเพาะเลี้ยงเซลล์ การคัดกรองด้วย CRISPR ได้เปลี่ยนแปลงสายพันธุ์เซลล์จากแบบจำลองการทดลองที่เฉื่อยชาไปเป็นเครื่องมือค้นพบที่กระตือรือร้น การตรวจสอบการทำงานอย่างเป็นระบบที่เกิดจากการคัดกรองทั่วทั้งจีโนมยังคงเปิดเผยชีววิทยาพื้นฐานและโอกาสทางการรักษา ทำให้เซลล์เพาะเลี้ยงเป็นเครื่องมือที่ขาดไม่ได้สำหรับการวิจัยทางชีววิทยาและการพัฒนายาสมัยใหม่