แพลตฟอร์มการคัดกรอง GPCR แบบใช้เซลล์ HEK Cell-Based High-Throughput

ตัวรับที่จับกับโปรตีน G (GPCRs) เป็นกลุ่มใหญ่ที่สุดของโปรตีนในเยื่อหุ้มเซลล์ในจีโนมมนุษย์ และคิดเป็นประมาณ 34% ของเป้าหมายยาทั้งหมดที่ Cytion เราตระหนักดีว่าการพัฒนาการรักษาที่มีประสิทธิภาพโดยมุ่งเป้าไปที่ GPCR ต้องอาศัยแพลตฟอร์มการคัดกรองเซลล์ที่มีความแข็งแกร่ง สามารถวัดการกระตุ้นตัวรับได้อย่างแม่นยำในสารประกอบนับพันถึงนับล้านชนิด เซลล์ HEK293 ได้กลายเป็นโฮสต์ที่ได้รับความนิยมสำหรับการแสดงออกและการคัดกรองการทำงานของ GPCR เนื่องจากมีการแสดงออกของตัวรับที่มีประสิทธิภาพ พื้นหลังของตัวรับภายในต่ำ และความเข้ากันได้กับรูปแบบการทดสอบที่หลากหลาย

ประเด็นสำคัญ

• เซลล์ HEK293 ให้พื้นหลังที่เหมาะสมสำหรับการแสดงออกของ GPCR ที่ไม่เหมือนกันโดยมีการรบกวนจากตัวรับภายในน้อยที่สุด
• รูปแบบการทดสอบที่หลากหลาย—การวัดการไหลของแคลเซียม, cAMP, การดึงดูด β-arrestin—ช่วยให้สามารถตรวจสอบเส้นทางได้อย่างครอบคลุม
• ระบบจัดการของเหลวอัตโนมัติและเครื่องอ่านเพลทช่วยให้สามารถคัดกรองสารประกอบได้มากกว่า 100,000 ชนิดต่อวัน
• กลยุทธ์การพัฒนาสายเซลล์ที่เสถียรต้องสร้างสมดุลระหว่างความต้องการในการผลิตกับความสม่ำเสมอของการทดสอบ
• การตรวจจับการกระตุ้นแบบลำเอียงต้องการการอ่านค่าแบบหลายตัวแปรผ่านกระบวนการส่งสัญญาณที่แตกต่างกัน

ทำไมเซลล์ HEK293 จึงโดดเด่นในการคัดกรอง GPCR

เซลล์ HEK293 ได้กลายเป็นมาตรฐานโดยปริยายสำหรับการทดสอบการทำงานของ GPCR เนื่องจากมีข้อได้เปรียบหลายประการในตัวเอง ประการแรก การแสดงออกของ GPCR ภายในเซลล์ที่ค่อนข้างต่ำช่วยลดสัญญาณรบกวนพื้นหลังที่อาจทำให้การศึกษาตัวรับที่ต่างชนิดกันเกิดความคลาดเคลื่อนได้ ซึ่งแตกต่างจากเซลล์ไลน์บางชนิดที่มาจากมะเร็งซึ่งมีการแสดงออกของ GPCR หลายชนิดในระดับที่มีความสำคัญต่อการทำงาน เซลล์ HEK293 จึงให้พื้นฐานที่สะอาดสำหรับการแสดงออกของตัวรับ

ประการที่สอง เซลล์ HEK293 แสดงออกโปรตีน G ทุกกลุ่มย่อยหลัก (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) ในระดับที่เพียงพอสำหรับการจับคู่กับตัวรับที่หลากหลาย ความสามารถในการส่งสัญญาณที่ครบถ้วนนี้ช่วยให้สามารถศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างตัวรับกับโปรตีน G ในสภาวะธรรมชาติได้โดยไม่จำเป็นต้องแสดงออกโปรตีน G กลุ่มย่อยเฉพาะร่วมกัน

ประการที่สาม เซลล์ HEK293 สามารถรับการถ่ายโอนยีนได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยใช้สารหลายประเภท ทำให้ได้อัตราการถ่ายโอนยีนเกิน 90% ประสิทธิภาพนี้ส่งผลให้ระดับการแสดงออกของตัวรับสูง โดยทั่วไปอยู่ที่ 10⁵ ถึง 10⁶ ตัวรับต่อเซลล์ ซึ่งให้ช่วงสัญญาณที่แข็งแกร่งแม้สำหรับตัวรับที่มีประสิทธิภาพการเชื่อมต่อปานกลาง

เซลล์ HEK293Tของเรา(300189)มีประสิทธิภาพในการถ่ายโอนยีนสูงเป็นพิเศษสำหรับการแสดงออกของ GPCR แบบชั่วคราว ทำให้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการกำหนดลักษณะตัวรับเบื้องต้นและการพัฒนาการทดสอบก่อนที่จะดำเนินการสร้างสายเซลล์ที่คงที่

การเลือกรูปแบบการทดสอบสำหรับการคัดกรอง GPCR

การวัดการไหลของแคลเซียม:ตัวรับที่จับกับ Gαq จะกระตุ้นฟอสโฟลิเปส C ซึ่งทำให้เกิดการปลดปล่อยแคลเซียมจากแหล่งเก็บภายในเซลล์ สีย้อมเรืองแสงที่ไวต่อแคลเซียม เช่น Fluo-4, Fura-2 หรือตัวบ่งชี้แคลเซียมที่ถูกเข้ารหัสทางพันธุกรรม ช่วยให้สามารถวัดการตอบสนองนี้ได้แบบเรียลไทม์เครื่องอ่านการเรืองแสงแบบใช้แผ่นเพลท เช่น FLIPR สามารถวัดการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมในเวลาร่วมกันทั่วทั้งแผ่นเพลทขนาด 384 หรือ 1536 หลุม โดยสามารถให้ผลผลิตได้มากกว่า 100,000 จุดข้อมูลต่อวัน

การทดสอบ cAMP:ตัวรับที่จับกับ Gαs กระตุ้นเอนไซม์อะดีนิลิลไซเคลส ทำให้ cAMP ภายในเซลล์เพิ่มขึ้น ในขณะที่ตัวรับที่จับกับ Gαi ยับยั้งการผลิต cAMPเทคโนโลยีการทดสอบหลายประเภทสามารถตรวจจับการเปลี่ยนแปลงของ cAMP ได้ รวมถึงการทดสอบแบบแข่งขันทางภูมิคุ้มกัน (HTRF, AlphaScreen), วิธีการที่ใช้ไบโอเซนเซอร์ (GloSensor) และการทดสอบด้วยยีนรีพอร์ตเตอร์ (CRE-luciferase) แต่ละวิธีมีข้อได้เปรียบที่แตกต่างกันในด้านความไว, ไคเนติกส์ และปริมาณงาน

การสรรหา β-Arrestin:การกระตุ้น GPCR จะกระตุ้นการสรรหา β-arrestin ไปยังตัวรับ ซึ่งเป็นกระบวนการที่สามารถวัดได้ผ่านการทดสอบการเติมเต็มโปรตีน เทคโนโลยีเช่น PathHunter (การเติมเต็มชิ้นส่วนเอนไซม์) และ NanoBiT (การแบ่ง luciferase) ให้การอ่านค่าที่ไวและไม่ขึ้นกับเส้นทาง ซึ่งสามารถนำไปใช้ได้กับตัวรับทุกประเภทโดยไม่คำนึงถึงความชอบในการจับคู่กับโปรตีน G

นักข่าว Gene Assays:ระบบนักข่าวการถอดรหัสวัดเหตุการณ์การส่งสัญญาณทางลง ซึ่งให้การขยายที่เพิ่มความไว นักข่าว CRE-luciferase ตรวจจับการกระตุ้นเส้นทาง cAMP, NFAT-luciferase ตอบสนองต่อการส่งสัญญาณแคลเซียม, และ SRE-luciferase ตรวจสอบหลายเส้นทาง แม้ว่าจะช้ากว่าการวัดสารส่งสัญญาณที่สองโดยตรง แต่การทดสอบนักข่าวให้อัตราส่วนสัญญาณต่อพื้นหลังที่ยอดเยี่ยม

กลยุทธ์การพัฒนาเซลล์ไลน์ที่เสถียร

การคัดกรองแบบปริมาณสูงมักต้องการสายเซลล์ที่คงที่ซึ่งแสดงออกของ GPCR เป้าหมายในระดับที่สม่ำเสมอในหลายพันล้านหลุมของการทดสอบ การพัฒนาสายเซลล์ที่คงที่เริ่มต้นด้วยการออกแบบเวกเตอร์ที่รวมทั้งตัวรับและเครื่องหมายที่สามารถเลือกได้ ทำให้สามารถเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ที่ถูกถ่ายโอนยีนอย่างคงที่

เซลล์ HEK293ของเรา(300192)ทำหน้าที่เป็นสายพันธุ์ต้นกำเนิดมาตรฐานสำหรับการสร้างสายเซลล์ที่คงตัว หลังจากการถ่ายโอนยีนและการคัดเลือกด้วยยาปฏิชีวนะ (โดยทั่วไป 2-4 สัปดาห์) เซลล์ที่รอดชีวิตจะผ่านการโคลนเซลล์เดี่ยวด้วยการเจือจางแบบจำกัดหรือการคัดแยกเซลล์ด้วยแสงเรืองแสง (FACS) จากนั้นโคลนแต่ละตัวจะถูกขยายและตรวจสอบลักษณะเฉพาะด้านระดับการแสดงออกของตัวรับ ขนาดของการตอบสนองทางหน้าที่ และความทนทานของการทดสอบ

คุณลักษณะคุณภาพที่สำคัญสำหรับการคัดกรองสายเซลล์ ได้แก่ ความเสถียรของการแสดงออกของยีนตลอดระยะเวลาการเพาะเลี้ยงที่ยาวนาน, เภสัชวิทยาที่สอดคล้องกันเมื่อเทียบกับมาตรฐานอ้างอิง, และประสิทธิภาพที่แข็งแกร่งในรูปแบบจานขนาดเล็ก ควรจัดตั้งธนาคารเซลล์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมตั้งแต่เริ่มต้นแคมเปญการคัดกรองเพื่อให้มั่นใจถึงประสิทธิภาพที่สม่ำเสมอตลอดกระบวนการ

สำหรับระยะเวลาที่เร่งด่วนขึ้นเซลล์ HEK293 EBNAของเรา(300264)ช่วยให้การแสดงออกของยีนจากเวกเตอร์แบบอีพิโซมมีความเสถียร ซึ่งอาจช่วยลดระยะเวลาในการพัฒนาในขณะที่ยังคงรักษาความสม่ำเสมอของการแสดงออก

ข้อพิจารณาเกี่ยวกับการย่อขนาดและการอัตโนมัติ

การเพิ่มประสิทธิภาพการคัดกรองให้สูงสุดจำเป็นต้องใช้การย่อขนาดลงเป็นรูปแบบ 384 หลุม, 1536 หลุม หรือแม้กระทั่ง 3456 หลุม เซลล์ HEK293 สามารถปรับตัวได้ดีกับการเพาะเลี้ยงในความหนาแน่นสูงในปริมาณที่ลดลง อย่างไรก็ตาม การปรับความหนาแน่นของเซลล์ สภาพการเพาะเลี้ยง และระยะเวลาการบ่มให้เหมาะสมอาจจำเป็นสำหรับการเปลี่ยนรูปแบบแต่ละครั้ง

เซลล์ HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการแขวนลอยมีข้อได้เปรียบสำหรับกระบวนการคัดกรองอัตโนมัติ เซลล์HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการแขวนลอย (300686)ของเราสามารถจ่ายได้โดยตรงจากภาชนะเพาะเลี้ยงไปยังจานทดสอบโดยไม่ต้องใช้ทริปซิน ซึ่งช่วยลดขั้นตอนการจัดการและเพิ่มความสม่ำเสมอ ความเข้ากันได้กับอุปกรณ์จัดการของเหลวอัตโนมัติช่วยให้สามารถดำเนินการคัดกรองแบบไม่ต้องเฝ้าดูได้จริงๆ

ข้อกำหนดด้านเสถียรภาพของแผ่นทดสอบจะแตกต่างกันไปตามรูปแบบการทดสอบ การวัดค่าการไหลของแคลเซียมมักต้องวัดภายในไม่กี่ชั่วโมงหลังจากการเติมสีย้อม ในขณะที่การทดสอบ cAMP และ β-arrestin อาจอนุญาตให้บ่มข้ามคืนก่อนการอ่านค่า การเข้าใจข้อจำกัดเหล่านี้จะช่วยให้การจัดการการคัดกรองและการจัดตารางอุปกรณ์เป็นไปอย่างมีประสิทธิภาพ

การวิเคราะห์ข้อมูลและการระบุเป้าหมาย

แคมเปญการคัดกรอง GPCR สร้างชุดข้อมูลขนาดใหญ่ซึ่งต้องการกระบวนการวิเคราะห์ที่แข็งแกร่ง พารามิเตอร์ทางสถิติรวมถึง Z'-factor, อัตราส่วนสัญญาณต่อพื้นหลัง, และสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวนประเมินคุณภาพของการทดสอบในแต่ละแผ่น แผ่นที่ล้มเหลวเกณฑ์คุณภาพควรทำการทดสอบใหม่แทนที่จะวิเคราะห์

เกณฑ์การระบุเป้าหมายต้องสมดุลระหว่างความไวกับอัตราการตรวจพบเท็จ ค่าเกณฑ์กิจกรรมที่ 50% ของการกระตุ้นหรือยับยั้งเมื่อเทียบกับสารอ้างอิงเป็นจุดเริ่มต้นที่เหมาะสม แม้ว่าค่าตัดที่เหมาะสมที่สุดจะขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของไลบรารีและเป้าหมายของโปรแกรม การยืนยันการตอบสนองต่อความเข้มข้นของเป้าหมายหลักจะช่วยขจัดสิ่งผิดปกติและจัดลำดับสารสำหรับการติดตามผล

การค้นพบยา GPCR สมัยใหม่ให้ความสำคัญกับการกระตุ้นแบบมีอคติมากขึ้น—สารประกอบที่กระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณบางเส้นทางมากกว่าเส้นทางอื่นๆ การตรวจหาสารประกอบที่มีอคติต้องใช้การทดสอบแบบขนานที่วัดหลายเส้นทาง (เช่น การกระตุ้นโปรตีน G เทียบกับการดึงดูด β-arrestin) โดยให้ความสนใจกับความไวและการเคลื่อนที่ของการทดสอบอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงอคติทางเทคนิค

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำสำหรับการคัดกรอง GPCR:

• เซลล์ HEK293T (300189)- การแสดงออกชั่วคราวที่มีประสิทธิภาพสูง
• เซลล์ HEK293 (300192)- การสร้างสายพันธุ์เซลล์ที่คงที่
• HEK293 ที่ปรับตัวให้เข้ากับการแขวนลอย (300686)- กระบวนการทำงานอัตโนมัติสำหรับการคัดกรอง
• เซลล์ HEK293 EBNA (300264)- การพัฒนาสายพันธุ์ที่เสถียรแบบเร่งด่วน
• DMEM น้ำตาลกลูโคสสูง (820300a)- สารอาหารเพาะเลี้ยงมาตรฐาน