การเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนชั่วคราวในสายพันธุ์เซลล์ HEK

การเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนชั่วคราวในสายพันธุ์เซลล์ HEK

การถ่ายโอนยีนชั่วคราวในสายพันธุ์เซลล์ HEK ยังคงเป็นหนึ่งในเทคนิคที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในชีววิทยาระดับโมเลกุล ช่วยให้สามารถแสดงโปรตีนได้อย่างรวดเร็ว ศึกษาการทำงานของยีน และผลิตเวกเตอร์ไวรัสโดยไม่จำเป็นต้องมีการรวมตัวทางพันธุกรรมอย่างถาวร การบรรลุประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนที่สูงอย่างสม่ำเสมอจำเป็นต้องมีการปรับค่าพารามิเตอร์หลายอย่างอย่างระมัดระวัง ตั้งแต่ความหนาแน่นของเซลล์และจำนวนครั้งที่ผ่านไปจนถึงการเลือกสารเคมีและคุณภาพของ DNAที่ Cytion เราจัดหาเซลล์ HEK293ที่ผ่านการรับรองความถูกต้องและสายพันธุ์เฉพาะทางรวมถึงเซลล์ HEK293Tซึ่งมอบวัสดุเริ่มต้นที่เชื่อถือได้แก่ผู้วิจัย เพื่อผลลัพธ์การถ่ายโอนยีนที่ดีที่สุดในหลากหลายการทดลองทางวิทยาศาสตร์

ประเด็นสำคัญ
สุขภาพและความหนาแน่นของเซลล์	การรักษาเซลล์ให้มีความหนาแน่นอยู่ที่ 70-80% พร้อมกับความมีชีวิตสูงและจำนวนครั้งที่ผ่านน้อยนั้น เป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการเพิ่มการดูดซึมและแสดงออกของ DNA ให้สูงสุด
การเลือกสารรีเอเจนต์	การเลือกใช้สารรีเอเจนต์ที่มีฐานเป็นไขมัน แคลเซียมฟอสเฟต หรือโพลีเอทิลีนอิไมน์ (PEI) ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ ขนาดการผลิต และการประยุกต์ใช้ในขั้นตอนถัดไป
คุณภาพและการเตรียม DNA	การเตรียมพลาสมิดที่ปราศจากเอนโดทอกซินพร้อมอัตราส่วน DNA ต่อสารรีเอเจนต์ที่เหมาะสมอย่างมีนัยสำคัญส่งผลต่ออัตราความสำเร็จของการถ่ายโอนยีน
ข้อควรพิจารณาเกี่ยวกับสื่อและซีรั่ม	สภาวะปราศจากซีรัมในระหว่างการก่อตัวของคอมเพล็กซ์ทรานส์เฟคชันและองค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเซลล์ในระยะฟื้นตัวมีผลต่อประสิทธิภาพการดูดซึมและการอยู่รอดของเซลล์
การคัดเลือกสายพันธุ์เซลล์	การเลือกสายพันธุ์ HEK293 ที่เหมาะสม (สายพันธุ์ดั้งเดิม, 293T, 293F, 293A) ตามเป้าหมายของการทดลองมีผลกระทบอย่างมากต่อผลลัพธ์

สุขภาพและความหนาแน่นของเซลล์เพื่อความสำเร็จสูงสุดในการถ่ายโอนยีน

สภาวะทางสรีรวิทยาของเซลล์ HEK ในช่วงเวลาของการทรานส์เฟคชันมีผลกำหนดประสิทธิภาพของการดูดซึม DNA และการแสดงออกของยีนที่ถ่ายทอดได้อย่างพื้นฐาน ผลลัพธ์ที่ดีที่สุดจะเกิดขึ้นอย่างสม่ำเสมอเมื่อเซลล์ HEK293มีระดับการเกาะกลุ่มกัน (confluence) อยู่ที่ 70-80% ซึ่งให้จำนวนเซลล์เพียงพอสำหรับการผลิตโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญ พร้อมทั้งยังคงมีระยะห่างระหว่างเซลล์ที่เหมาะสมสำหรับคอมเพล็กซ์ทรานส์เฟคชันในการเข้าถึงแต่ละเซลล์โดยไม่เกิดการแข่งขันวัฒนธรรมที่ใกล้จะรวมตัวกันอย่างสมบูรณ์จะแสดงการยับยั้งการติดต่อและการชะลอการเผาผลาญซึ่งทำให้ความสามารถในการดูดซึม DNA ภายนอกลดลงอย่างมาก ในขณะที่ประชากรที่เบาบางเกินไปจะสิ้นเปลืองสารตั้งต้นที่มีราคาแพงและให้ผลผลิตไม่เพียงพอสำหรับการวิเคราะห์ในขั้นตอนต่อไปความมีชีวิตของเซลล์ควรเกิน 95% ก่อนการทรานส์เฟค เนื่องจากเซลล์ที่กำลังตายหรือเครียดจะปล่อยโปรตีเอสและนิวคลีเอสซึ่งจะย่อยสลายคอมเพล็กซ์ทรานส์เฟคก่อนที่เซลล์จะดูดซึมได้ จำนวนครั้งที่ผ่าน (passage number) เป็นตัวแปรสำคัญอีกประการหนึ่ง โดยปกติเซลล์ HEK293Tจะทำงานได้ดีที่สุดระหว่าง passage ที่ 5 ถึง 25 หลังจากนั้นการเลื่อนไหลทางพันธุกรรมและการสะสมของกลายพันธุ์จะค่อยๆ ลดความสามารถในการทรานส์เฟคลงการบันทึกข้อมูลการเพาะเลี้ยงอย่างละเอียดและการสร้างวัฒนธรรมใหม่จากสต็อกที่ได้รับการยืนยัน เช่นHEK293T/17 Cellsช่วยให้การทดลองสามารถทำซ้ำได้ในการวิจัยระยะยาว การกำหนดเวลาการเพาะเซลล์ก่อนการถ่ายโอนยีนก็มีความสำคัญ โดยส่วนใหญ่แนะนำให้ใช้เวลา 18-24 ชั่วโมงในการฟื้นฟูเซลล์หลังการแยกเซลล์ด้วยทริปซิน เพื่อให้เซลล์สามารถยึดเกาะใหม่ แพร่กระจายอย่างเหมาะสม และเริ่มกระบวนการวงจรเซลล์อย่างเต็มที่ก่อนที่จะสัมผัสกับสารที่ใช้ในการถ่ายโอนยีนนักวิจัยที่ทำงานกับสายพันธุ์HEK293 ที่ปรับตัวให้เหมาะสมกับการเลี้ยงแบบแขวนลอยควรตั้งเป้าหมายความหนาแน่นของเซลล์ที่ 1-2 × 10⁶ เซลล์ต่อมิลลิลิตร โดยมีอัตราการอยู่รอดเกินกว่า 98% เพื่อให้ได้ประสิทธิภาพการทรานส์เฟคชันที่เทียบเคียงได้ในรูปแบบการเลี้ยงแบบแขวนลอย

การเลือกสารตั้งต้นสำหรับการถ่ายโอนยีนส์ที่มีประสิทธิภาพสูงสุด

การเลือกสารช่วยการถ่ายโอนที่เหมาะสมต้องคำนึงถึงประสิทธิภาพ ต้นทุน ความสามารถในการขยายขนาด และความเข้ากันได้กับสายพันธุ์เซลล์ HEK ที่เฉพาะเจาะจงและการประยุกต์ใช้ในขั้นตอนต่อไป สารช่วยที่มีพื้นฐานจากไขมัน เช่น Lipofectamine ยังคงเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการถ่ายโอนในระดับเล็กในเซลล์ HEK293 โดยสร้างสารประกอบลิโพโซมที่รวมตัวกับเยื่อหุ้มเซลล์และส่งมอบ DNA ด้วยความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำและประสิทธิภาพที่เกินกว่า 90% อย่างสม่ำเสมออย่างไรก็ตาม ต้นทุนที่สูงต่อไมโครกรัมของดีเอ็นเอที่ถูกถ่ายโอนทำให้วิธีการที่ใช้ไขมันเป็นฐานมีข้อจำกัดทางเศรษฐกิจสำหรับการผลิตเวกเตอร์ไวรัสหรือการผลิตโปรตีนในปริมาณมาก การตกตะกอนด้วยแคลเซียมฟอสเฟตเป็นทางเลือกที่คุ้มค่าซึ่งได้รับการใช้มาอย่างประสบความสำเร็จเป็นเวลาหลายทศวรรษ โดยเฉพาะอย่างยิ่งกับเซลล์ HEK293Tซึ่งวิธีนี้สามารถบรรลุประสิทธิภาพที่ยอดเยี่ยมในการผลิตเวกเตอร์ไวรัสเลนติไวรัสและเรโทรไวรัสด้วยต้นทุนเพียงเศษเสี้ยวของราคาสารเคมีเชิงพาณิชย์เทคนิคนี้ต้องการการควบคุมค่า pH อย่างแม่นยำและการเตรียมบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม แต่จะให้ผลลัพธ์ที่ซ้ำได้เมื่อปรับให้เหมาะสมอย่างระมัดระวัง และสามารถนำไปใช้ในขนาดที่ไม่จำกัดเกือบทุกขนาด โพลีเอทิลีนอิไมน์ (PEI) ได้กลายเป็นสารที่ใช้ในการทรานส์เฟคชันที่ได้รับความนิยมสำหรับเซลล์HEK293 ที่ปรับตัวให้อยู่ในรูปแบบแขวนลอยในระดับอุตสาหกรรม โดยให้สมดุลที่ยอดเยี่ยมระหว่างประสิทธิภาพ ต้นทุน และความสามารถในการขยายขนาด ซึ่งสนับสนุนการผลิตโปรตีนบำบัดและเวกเตอร์ไวรัสที่ใช้ในกระบวนการผลิตในถังชีวภาพPEI ลีนี어ที่มีน้ำหนักโมเลกุลระหว่าง 25-40 kDa ให้การรวมตัวที่ดีที่สุดกับ DNA plasmid ขณะเดียวกันก็ลดความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับน้ำหนักโมเลกุลที่สูงขึ้นหรือตัวแปรที่มีกิ่งก้านสาขาสำหรับการประยุกต์ใช้เฉพาะทางที่ต้องการการผลิตเวกเตอร์อะดีโนไวรัสเซลล์ AAV-293ตอบสนองต่อการถ่ายโอนยีนด้วย PEI เป็นอย่างดี ซึ่งสนับสนุนการผลิตเวกเตอร์ในปริมาณสูงที่จำเป็นสำหรับการผลิตยีนบำบัด ไม่ว่าจะเลือกสารเคมีใด การกำหนดอัตราส่วนระหว่าง DNA กับสารเคมีผ่านการทดลองหาค่าที่เหมาะสมอย่างเป็นระบบเฉพาะกับแต่ละสายพันธุ์เซลล์และพลาสมิด จะช่วยให้ได้ประสิทธิภาพสูงสุดในขณะที่ยังคงรักษาสุขภาพของเซลล์เพื่อการแสดงออกของโปรตีนที่ดีที่สุด

คุณภาพของ DNA และการเตรียมความพร้อมเพื่อการถ่ายโอนยีนที่เชื่อถือได้

คุณภาพของดีเอ็นเอพลาสมิดที่ใช้ในการถ่ายโอนยีนมีอิทธิพลอย่างลึกซึ้งต่อทั้งประสิทธิภาพการดูดซึมและระดับการแสดงออกของยีนในขั้นตอนถัดไป อย่างไรก็ตาม พารามิเตอร์สำคัญนี้มักไม่ได้รับความสนใจเพียงพอในระหว่างการวางแผนการทดลองการปนเปื้อนเอนโดทอกซินเป็นสาเหตุที่พบได้บ่อยที่สุดของความล้มเหลวในการถ่ายโอนยีนที่ไม่สามารถอธิบายได้ เนื่องจากลิโพโพลีแซ็กคาไรด์ที่บริสุทธิ์ร่วมกับพลาสมิดดีเอ็นเอจะกระตุ้นการตอบสนองการอักเสบในเซลล์ HEK293ซึ่งส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์และเบี่ยงเบนกลไกของเซลล์จากการแสดงออกของยีนที่ถ่ายโอน ชุดอุปกรณ์การบริสุทธิ์ที่ปราศจากเอนโดทอกซินเชิงพาณิชย์สามารถบรรลุระดับที่ต่ำกว่า 0.1 EU ต่อไมโครกรัมของดีเอ็นเอได้อย่างน่าเชื่อถือ ซึ่งเป็นเกณฑ์ที่ถือว่าปลอดภัยสำหรับการใช้งานเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีความไวสูงโครงสร้างของพลาสมิดยังมีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อประสิทธิภาพของการถ่ายโอนยีน โดยตัวอย่างพลาสมิดที่อยู่ในรูปซูเปอร์โคiled จะให้ประสิทธิภาพสูงกว่าพลาสมิดที่อยู่ในรูปวงกลมคลายตัวหรือเส้นตรง เนื่องจากโครงสร้างที่กระชับช่วยให้เกิดการรวมตัวที่ซับซ้อนและถูกดูดซึมเข้าสู่เซลล์ได้ดีขึ้น การวิเคราะห์ทางสเปกโตรโฟโตเมตริกควรยืนยันค่าอัตราส่วน A260/A280 ระหว่าง 1.8 ถึง 2.0 และค่าอัตราส่วน A260/A230 ที่มากกว่า 2.0 ซึ่งบ่งชี้ถึงการปนเปื้อนของโปรตีนและสารละลายอินทรีย์ในระดับต่ำสำหรับการถ่ายโอนหลายพลาสมิดที่ใช้บ่อยในการผลิตเวกเตอร์ไวรัสโดยใช้เซลล์ HEK293T การรักษาสัดส่วนโมลที่เท่ากันระหว่างโครงสร้างการถ่ายโอน, การบรรจุ, และโครงสร้างหุ้มจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของความสามารถในการทำงานสูงสุดในขณะที่ป้องกันการแย่งชิงเครื่องจักรการแสดงออกของเซลล์อัตราส่วนของ DNA ต่อสารรีเอเจนต์ต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมตามประสบการณ์สำหรับแต่ละชุดของพลาสมิดและเซลล์ โดยจุดเริ่มต้นทั่วไปคืออัตราส่วนน้ำหนัก 1:2 ถึง 1:3 สำหรับโปรโตคอลที่ใช้ PEI และอัตราส่วนที่แนะนำโดยผู้ผลิตสำหรับสารลิพิดเชิงพาณิชย์ขนาดพลาสมิดมีผลต่ออัตราส่วนที่เหมาะสม เนื่องจากโครงสร้างขนาดใหญ่ เช่น โครงสร้างที่เข้ารหัส Cas9 แบบเต็มความยาวพร้อมกับชุด RNA ไกด์ จะได้รับประโยชน์จากการเพิ่มความเข้มข้นของสารตั้งต้นเล็กน้อยเพื่อให้มั่นใจในการเกิดสารประกอบที่สมบูรณ์ เมื่อทำการถ่ายโอนยีนในเซลล์HEK293 ที่ปรับให้อยู่ในรูปแบบแขวนลอยในสื่อที่ไม่มีซีรัม การสร้างสารประกอบ DNA ในสภาวะที่ไม่มีโปรตีนซีรัมจะดำเนินไปอย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ซึ่งมักทำให้สามารถใช้ปริมาณสารตั้งต้นที่น้อยลงเมื่อเทียบกับวิธีการที่มีซีรัม ในขณะที่ยังคงรักษาอัตราการถ่ายโอนยีนที่เทียบเท่าหรือดีกว่า

ข้อควรพิจารณาเกี่ยวกับสื่อและซีรัมเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทรานส์เฟคชัน

องค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งก่อน ระหว่าง และหลังการถ่ายโอนยีนมีอิทธิพลอย่างมากต่อประสิทธิภาพในการดูดซึมสารประกอบดีเอ็นเอและการอยู่รอดของเซลล์ในระยะการแสดงออกของยีนทรานส์เจน สภาพปลอดซีรัมในระหว่างการก่อตัวของสารประกอบถ่ายโอนยีนมีความจำเป็นอย่างยิ่งต่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เนื่องจากโปรตีนในซีรัมสามารถจับกับลิพิดประจุบวกและพอลิเมอร์ได้ง่าย ทำให้ประจุของสารเหล่านี้เป็นกลางและขัดขวางการควบแน่นของดีเอ็นเออย่างมีประสิทธิภาพเมื่อเตรียมคอมเพล็กซ์ที่มี PEI หรือไขมันเป็นฐานสำหรับเซลล์ HEK293 การเจือจางทั้ง DNA และสารรีเอเจนต์ในDMEMหรือ Opti-MEM ที่ปราศจากเซรั่มจะช่วยให้การประกอบคอมเพล็กซ์เป็นไปอย่างราบรื่นและคงขนาดการกระจายตัวของอนุภาคให้สม่ำเสมอ ซึ่งเอื้อต่อการเข้าสู่เซลล์ การบ่มเพื่อสร้างคอมเพล็กซ์โดยทั่วไปใช้เวลาประมาณ 15 ถึง 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง โดยหากบ่มนานเกินไปอาจเกิดการรวมตัวของอนุภาค ส่งผลให้ประสิทธิภาพการทรานส์เฟคชันลดลงและเพิ่มความเป็นพิษต่อเซลล์หลังจากการเติมที่ซับซ้อนในเซลล์ หลายโปรโตคอลแนะนำให้ทำการบ่มเป็นเวลา 4-6 ชั่วโมงในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีซีรัมต่ำหรือไม่มีซีรัม ก่อนที่จะเปลี่ยนเป็นอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มีซีรัมสมบูรณ์ซึ่งมีซีรัมจากเลือดวัวในครรภ์ 10% เพื่อสนับสนุนการฟื้นตัวของเซลล์และการแสดงออกของโปรตีน สำหรับเซลล์HEK293 ที่ปรับตัวให้อยู่ในรูปแบบแขวนลอยที่เพาะเลี้ยงในระบบที่ไม่มีซีรัมและกำหนดทางเคมีอย่างชัดเจน การพิจารณาดังกล่าวจะง่ายขึ้นเนื่องจากเซลล์เหล่านี้เจริญเติบโตได้ดีโดยไม่ต้องเสริมซีรัมตลอดระยะเวลาการถ่ายโอนยีนและการแสดงออกของโปรตีนการเลือกใช้สื่อพื้นฐานก็ควรให้ความสำคัญเช่นกัน โดยHam's F12K MediumและDMEM:Ham's F12blends สามารถเพิ่มความสามารถในการบัฟเฟอร์และโปรไฟล์สารอาหารที่สนับสนุนความต้องการทางเมตาบอลิซึมของการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ระดับสูงได้ ควรหลีกเลี่ยงการใช้ยาปฏิชีวนะในระหว่างขั้นตอนการทรานส์เฟคชั่น เนื่องจากการทำให้เยื่อหุ้มเซลล์ซึมผ่านได้มากขึ้นจากสารที่ใช้ในการทรานส์เฟคชั่นอาจทำให้ยาปฏิชีวนะเข้าสู่เซลล์ในปริมาณที่เป็นพิษ ส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์และทำให้การตีความผลการทดลองผิดพลาด

การคัดเลือกสายพันธุ์เซลล์สำหรับผลลัพธ์การทดลองที่มุ่งเป้า

ตระกูล HEK293 ประกอบด้วยสายเซลล์อนุพันธ์จำนวนมาก ซึ่งแต่ละสายถูกดัดแปลงหรือคัดเลือกให้มีลักษณะเฉพาะที่มอบข้อได้เปรียบที่แตกต่างกันสำหรับการประยุกต์ใช้การทรานส์เฟคชันเฉพาะด้านเซลล์ HEK293ต้นกำเนิดยังคงถูกใช้งานอย่างแพร่หลายในงานทดลองทรานส์เฟคชันทั่วไป เนื่องจากให้ประสิทธิภาพที่เชื่อถือได้กับหลากหลายโปรโตคอล โดยไม่จำเป็นต้องมีการดัดแปลงพันธุกรรมเพิ่มเติมเหมือนในสายอนุพันธ์เซลล์สายพันธุ์ HEK293Tแสดงออกของแอนติเจน T ขนาดใหญ่ของ SV40 ซึ่งช่วยให้เกิดการจำลองแบบแบบอีพิโซมของพลาสมิดที่มีต้นกำเนิดจาก SV40 และเพิ่มระดับการแสดงออกชั่วคราวอย่างมากสำหรับการใช้งานที่ต้องการผลผลิตโปรตีนสูงสุดหรือค่าความเข้มข้นของไวรัส คุณลักษณะนี้ทำให้ HEK293T เป็นตัวเลือกที่ได้รับความนิยมสำหรับการผลิตเวกเตอร์ไวรัสเลนติไวรัส เรโทรไวรัส และอะดีโน-แอโซซิเอทเต็ดไวรัส ซึ่งปริมาณผลผลิตมีผลโดยตรงต่อความสำเร็จของการทดลองในขั้นตอนต่อไปเซลล์ HEK293T/17subclone มีความสม่ำเสมอที่ดีกว่าเมื่อเทียบกับประชากร 293T ต้นกำเนิด เนื่องจากได้รับการคัดเลือกเพื่อความสามารถในการทรานส์เฟคชั่นที่เหนือกว่าและลักษณะการเจริญเติบโตที่เสถียร ซึ่งจำเป็นสำหรับกระบวนการผลิตไวรัสที่สามารถทำซ้ำได้ สำหรับนักวิจัยที่ต้องการระบบเวกเตอร์อะดีโนไวรัสเซลล์ HEK293Aให้รูปร่างที่แบนราบพร้อมคุณสมบัติการยึดเกาะที่ดีขึ้น ซึ่งเอื้อต่อการทดสอบแผ่นเพลคและการคัดกรองแบบจัดเรียงในรูปแบบหลายหลุมสายพันธุ์HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการเลี้ยงแบบแขวนลอยนี้ตอบโจทย์ความต้องการด้านขนาดการผลิต สามารถเพาะเลี้ยงในขวดสั่นและถังชีวภาพแบบกวนสำหรับการผลิตโปรตีนบำบัดและไวรัสเวกเตอร์ในระดับอุตสาหกรรมได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในทำนองเดียวกัน เซลล์HEK293-Fได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการเลี้ยงแบบแขวนลอยในความหนาแน่นสูงโดยปราศจากซีรัม ซึ่งช่วยให้สามารถจัดทำเอกสารแหล่งที่มาที่สอดคล้องกับข้อกำหนดด้านกฎระเบียบ ส่งผลให้กระบวนการพัฒนาการผลิตสำหรับการใช้งานทางคลินิกเป็นไปอย่างราบรื่นห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้องกับการแสดงโปรตีนเฉพาะทางอาจได้รับประโยชน์จากเซลล์ HEK293 EBNA ซึ่งแสดงแอนติเจนนิวเคลียร์ของไวรัสเอปสไตน์-บาร์ร์ (Epstein-Barr virus nuclear antigen 1) อย่างคงที่ เพื่อสนับสนุนการรักษาอีพิโซมอลของเวกเตอร์การแสดงที่มี oriP ทำให้สามารถแสดงโปรตีนในระดับสูงอย่างต่อเนื่องเป็นระยะเวลานานโดยไม่เกิดการรวมเข้ากับจีโนม