เซลล์ HEK สำหรับการผลิตเวกเตอร์ AAV: โปรโตคอลและแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุด

ไวรัสอะดีโน-แอโซซิเอท (AAV) ได้กลายเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการนำไปใช้ในด้านการบำบัดทางพันธุกรรม โดยมอบโปรไฟล์ความปลอดภัยที่ยอดเยี่ยมและความสามารถในการถ่ายทอดยีนไปยังทั้งเซลล์ที่กำลังแบ่งตัวและเซลล์ที่ไม่กำลังแบ่งตัว ที่ Cytion เราทราบดีว่าการผลิต AAV ที่ประสบความสำเร็จเริ่มต้นจากการคัดเลือกและเพาะเลี้ยงสายพันธุ์เซลล์ที่เหมาะสมที่สุดเซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ 293 (HEK293) และอนุพันธ์ของเซลล์เหล่านี้ได้กลายเป็นแพลตฟอร์มหลักสำหรับการผลิต AAV เนื่องจากมีประสิทธิภาพในการถ่ายโอนยีนสูง ลักษณะการเจริญเติบโตที่แข็งแรง และความสามารถในการสนับสนุนการจำลองไวรัสอย่างมีประสิทธิภาพ

ประเด็นสำคัญ

• เซลล์ HEK293T และ HEK293-F เป็นแพลตฟอร์มหลักสำหรับการผลิตเวกเตอร์ AAV ที่สามารถปรับขนาดได้
• โปรโตคอลการทรานส์เฟคชันสามครั้งยังคงเป็นมาตรฐานอุตสาหกรรมสำหรับการผลิต AAV ระดับวิจัย
• การเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยปราศจากซีรั่มช่วยให้สามารถผลิตได้ในปริมาณมากและสอดคล้องกับมาตรฐาน GMP
• การปรับความหนาแน่นของเซลล์และการกำหนดเวลาการถ่ายโอนยีนมีผลกระทบอย่างมากต่อปริมาณไวรัส
• มาตรการควบคุมคุณภาพรวมถึงการกำหนดระดับความเข้มข้นและการประเมินความบริสุทธิ์ เพื่อให้มั่นใจว่าเวกเตอร์มีคุณภาพระดับการรักษา

การทำความเข้าใจการเลือกสายพันธุ์เซลล์ HEK293 สำหรับการผลิต AAV

การเลือกสายพันธุ์ HEK293 ที่เหมาะสมเป็นปัจจัยพื้นฐานที่กำหนดความสำเร็จของแคมเปญการผลิต AAV ของคุณ ที่ Cytion เรามีพอร์ตโฟลิโอที่ครอบคลุมของอนุพันธ์ HEK293 ซึ่งแต่ละชนิดได้รับการปรับแต่งให้เหมาะสมกับความต้องการในการผลิตเฉพาะ

เซลล์ HEK293Tแสดงออกของแอนติเจน SV40 Large T ซึ่งช่วยให้พลาสมิดที่มีต้นกำเนิดการจำลองแบบของ SV40 สามารถจำลองแบบแบบ episomal ได้ คุณลักษณะนี้ทำให้เซลล์ HEK293T เหมาะอย่างยิ่งสำหรับโปรโตคอลการถ่ายโอนยีนชั่วคราว โดยให้ค่าไวรัสไทเตอร์สูงอย่างสม่ำเสมอในการผลิตในระดับการวิจัยเซลล์ HEK293Tของเรา(300189)ผ่านการควบคุมคุณภาพอย่างเข้มงวดเพื่อให้มั่นใจในประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนที่เหมาะสมที่สุดและผลผลิต AAV ที่สม่ำเสมอ

สำหรับการใช้งานการผลิตขนาดใหญ่เซลล์ HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการเลี้ยงแบบแขวนลอยมีข้อได้เปรียบที่สำคัญ เซลล์HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการเลี้ยงแบบแขวนลอย (300686)ของเราได้รับการปรับให้เหมาะสมโดยเฉพาะสำหรับการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยที่ปราศจากซีรัม ทำให้สามารถผลิตในถังชีวภาพแบบกวนที่มีขนาดเกิน 2000 ลิตรได้

สายพันธุ์HEK293-F (300260)เป็นมาตรฐานอุตสาหกรรมสำหรับการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอย แสดงให้เห็นถึงลักษณะการเจริญเติบโตที่ยอดเยี่ยมในอาหารเลี้ยงเชื้อที่กำหนดด้วยสารเคมีอย่างสมบูรณ์ ปราศจากเซรั่ม พร้อมทั้งรักษาประสิทธิภาพการทรานส์เฟคชั่นในระดับสูง

การปรับแต่งโปรโตคอลการทรานส์เฟกชันสามครั้ง

วิธีการทรานส์เฟคสามครั้งยังคงเป็นวิธีที่ได้รับความนิยมมากที่สุดในการผลิต AAV โดยมีความยืดหยุ่นในการเลือกซีโรไทป์และการบรรจุทรานส์จีน โปรโตคอลนี้ต้องการส่วนประกอบพลาสมิดสามชนิด ได้แก่ พลาสมิดเวกเตอร์ AAV ที่มียีนที่คุณต้องการสนใจอยู่ระหว่าง ITRs, พลาสมิดช่วยที่ให้ฟังก์ชันของอะดีโนไวรัส และพลาสมิดบรรจุที่เข้ารหัสยีน Rep และ Cap

การถ่ายโอนยีนที่ประสบความสำเร็จเริ่มต้นด้วยเซลล์ที่มีความหนาแน่นและความมีชีวิตอยู่ในระดับที่เหมาะสม สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ HEK293T ที่ยึดเกาะ ให้หว่านเซลล์ 18-24 ชั่วโมงก่อนการถ่ายโอนยีนเพื่อให้ได้ความหนาแน่น 70-80% สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยโดยใช้เซลล์ HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการแขวนลอย ให้ตั้งเป้าหมายความหนาแน่นที่ 1.5-2.0 × 10⁶ เซลล์ที่มีชีวิต/มิลลิลิตร โดยมีความมีชีวิตมากกว่า 95%

การก่อตัวของคอมเพล็กซ์ DNA มีผลกระทบอย่างมากต่อประสิทธิภาพของการถ่ายโอนยีน รักษาอัตราส่วน DNA ที่ 1:1:1 สำหรับการผสมพลาสมิดที่มีโมลเท่ากัน หรือปรับให้เหมาะสมตามโครงสร้างเฉพาะของคุณความเข้มข้นของ DNA ทั้งหมดที่ 1-1.5 μg ต่อล้านเซลล์โดยทั่วไปจะให้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด DNA ที่ซับซ้อนร่วมกับโพลีเอทิลีนอิไมน์ (PEI) ในอัตราส่วน DNA:PEI 1:2 ถึง 1:4 (น้ำหนักต่อน้ำหนัก) โดยให้เวลาสำหรับการสร้างสารประกอบเชิงซ้อน 15-20 นาทีก่อนเติมลงในเซลล์

เงื่อนไขของสื่อและวัฒนธรรมเพื่อผลลัพธ์สูงสุด

องค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อมีผลโดยตรงต่อสุขภาพของเซลล์และความสามารถในการผลิตไวรัส สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบเกาะติด เราขอแนะนำให้ใช้DMEM ที่มีกลูโคส 4.5 กรัม/ลิตร (820300a)เสริมด้วยเซรั่มจากเลือดวัวอ่อน 10% ในช่วงการเจริญเติบโต

การเปลี่ยนไปใช้สภาวะปลอดซีรั่มหลังจากการถ่ายโอนยีนสามารถเพิ่มประสิทธิภาพในการทำให้บริสุทธิ์ในขั้นตอนต่อไปและลดความแปรปรวนระหว่างแต่ละล็อตได้ สูตรปลอดซีรั่มของเราช่วยสนับสนุนการผลิตไวรัสที่แข็งแกร่งในขณะที่ทำให้การปฏิบัติตามข้อกำหนดด้านกฎระเบียบสำหรับการผลิตเวกเตอร์ระดับคลินิกง่ายขึ้น

อุณหภูมิและระดับ CO₂ จำเป็นต้องได้รับการควบคุมอย่างแม่นยำตลอดทั้งวงจรการผลิต ควรรักษาวัฒนธรรมไว้ที่ 37°C ± 0.5°C โดยมี CO₂ 5% และความชื้นสัมพัทธ์มากกว่า 80% โปรโตคอลบางประเภทจะได้ประโยชน์จากการลดอุณหภูมิลงเหลือ 32-34°C หลังการถ่ายโอนยีน ซึ่งสามารถช่วยเพิ่มการพับตัวของโปรตีนและการประกอบตัวของไวรัส พร้อมทั้งลดความเครียดทางเมตาบอลิซึมของเซลล์

การกำหนดเวลาการเก็บเกี่ยวและกลยุทธ์การฟื้นตัวของไวรัส

ช่วงเวลาการเก็บเกี่ยวที่เหมาะสมที่สุดคือการสร้างสมดุลระหว่างการสะสมไวรัสสูงสุดกับการเสื่อมสภาพของเซลล์ สำหรับซีโรไทป์ของ AAV ส่วนใหญ่ การเก็บเกี่ยวระหว่าง 48-72 ชั่วโมงหลังการถ่ายโอนยีนจะให้ค่าความเข้มข้นของไวรัสที่มีประสิทธิภาพสูงสุด ติดตามความมีชีวิตของเซลล์ทุกวัน หากความมีชีวิตลดลงต่ำกว่า 70% บ่งชี้ถึงความเครียดของเซลล์ที่อาจส่งผลต่อคุณภาพของเวกเตอร์

อนุภาค AAV กระจายตัวระหว่างช่องภายในเซลล์และช่องภายนอกเซลล์ โดยมีอัตราส่วนที่แตกต่างกันตามชนิดซีโรไทป์ AAV2 และ AAV5 ยังคงเกาะติดกับเซลล์เป็นส่วนใหญ่ จำเป็นต้องมีการสลายเซลล์อย่างทั่วถึงเพื่อให้ได้ผลผลิตที่มีประสิทธิภาพ ในทางตรงกันข้าม AAV8 และ AAV9 แสดงการปลดปล่อยเข้าสู่ของเหลวเหนือเซลล์ในวัฒนธรรมอย่างมีนัยสำคัญ ทำให้สามารถเก็บเกี่ยวได้ง่ายขึ้น

โปรโตคอลการแตกตัวของเซลล์ต้องสร้างสมดุลระหว่างการปลดปล่อยอนุภาคอย่างสมบูรณ์กับการสลายโปรตีนและการปนเปื้อนของดีเอ็นเอ การทำวัฏจักรแช่แข็ง-ละลาย (3-5 รอบระหว่าง -80°C และ 37°C) ให้การแตกตัวที่อ่อนโยน เหมาะสำหรับการผลิตในระดับการวิจัย สำหรับขนาดที่ใหญ่ขึ้น การแตกตัวด้วยสารลดแรงตึงผิวหรือการทำลายเชิงกลให้ผลลัพธ์ที่ซ้ำได้มากกว่า

ข้อพิจารณาเกี่ยวกับการทำให้บริสุทธิ์และการควบคุมคุณภาพ

การทำให้บริสุทธิ์ด้วยเวกเตอร์จะกำจัดเศษซากเซลล์ โปรตีนจากเซลล์โฮสต์ และดีเอ็นเอที่เหลืออยู่ ในขณะที่เพิ่มความเข้มข้นของอนุภาคไวรัสที่มีการทำงาน การแยกความหนาแน่นด้วยแรงเหวี่ยงแบบอัลตราเซนทริฟิวเจชันโดยใช้ซีเซียมคลอไรด์หรือไอโอดีกซาโนลยังคงเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการใช้งานวิจัย โดยสามารถให้ความบริสุทธิ์ที่เหมาะสมสำหรับการศึกษาในหลอดทดลองและการศึกษาก่อนคลินิกส่วนใหญ่

สำหรับการผลิตในระดับคลินิก วิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีมีข้อดีในเรื่องความสามารถในการปรับขนาดและการทำซ้ำที่ดีขึ้น โครมาโทกราฟีแบบเลือกจับโดยใช้เรซินที่จำเพาะต่อซีโรไทป์ ตามด้วยการขัดเกลาด้วยไอออนเอ็กซ์เชนจ์ สามารถให้ความบริสุทธิ์ได้มากกว่า 99% พร้อมอัตราการคืนผลผลิต 50-70%

การทดสอบการควบคุมคุณภาพควรครอบคลุมถึงระดับไทเทอร์ (จีโนมไวรัสและอนุภาคที่ติดเชื้อ), ความบริสุทธิ์ (องค์ประกอบของโปรตีนและ DNA ที่เหลือ), ความแรง (การแสดงออกของยีนทรานส์), และความปลอดภัย (ความปราศจากเชื้อ, เอ็นโดทอกซิน, ไมโคพลาสมา) กำหนดข้อกำหนดการปล่อยที่เหมาะสมกับการใช้งานที่ตั้งใจไว้ โดยต้องมีข้อกำหนดที่เข้มงวดมากขึ้นสำหรับวัสดุที่ใช้ในทางคลินิก

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำสำหรับการผลิต AAV:

• เซลล์ HEK293T (300189)- เหมาะที่สุดสำหรับโปรโตคอลการถ่ายโอนชั่วคราว
• HEK293 ที่ปรับให้เข้ากับการแขวนลอย (300686)- การผลิตแบบแขวนลอยที่สามารถปรับขนาดได้
• HEK293-F (300260)- สายการผลิตแบบแขวนมาตรฐานอุตสาหกรรม
• DMEM น้ำตาลกลูโคสสูง (820300a)- สารอาหารพื้นฐานสำหรับการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ