วิศวกรรมเมตาบอลิกของ HEK293 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการเติมน้ำตาลให้กับโปรตีน

การเติมน้ำตาล (Glycosylation) เป็นหนึ่งในการดัดแปลงหลังการแปลที่สำคัญที่สุดซึ่งมีผลต่อประสิทธิภาพ ความคงตัว และความสามารถในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของโปรตีนที่ใช้ในทางการรักษาที่ Cytion เราเข้าใจดีว่าการผลิตโปรตีนรีคอมบิแนนท์ที่มีโปรไฟล์ไกลแคนที่เหมาะสมนั้นต้องอาศัยความเข้าใจที่ลึกซึ้งเกี่ยวกับกระบวนการเมตาบอลิซึมของเซลล์และกลไกการไกลโคซิเลชัน เซลล์ HEK293 มอบแพลตฟอร์มที่มีข้อได้เปรียบเฉพาะตัวสำหรับการผลิตไกลโคโปรตีน เนื่องจากมีต้นกำเนิดจากมนุษย์ จึงทำให้ได้รูปแบบการไกลโคซิเลชันที่ใกล้เคียงกับโปรตีนในร่างกายมนุษย์ ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบที่สำคัญเหนือกว่าระบบการแสดงออกที่ไม่ใช่มนุษย์

ประเด็นสำคัญ

• เซลล์ HEK293 ผลิตโครงสร้างไกลแคนที่สามารถเข้ากันได้กับมนุษย์ได้ดีกว่าเซลล์ CHO สำหรับการรักษาบางประเภท
• การเสริมสารตั้งต้นน้ำตาลนิวคลีโอไทด์ช่วยเพิ่มการยึดเกาะของตำแหน่งไกลโคซิเลชันโดยตรง
• สภาพแวดล้อมทางวัฒนธรรม เช่น อุณหภูมิ ค่า pH และออกซิเจนที่ละลายน้ำ มีผลกระทบอย่างลึกซึ้งต่อโปรไฟล์ของไกลแคน
• แนวทางวิศวกรรมพันธุกรรมช่วยให้สามารถปรับแต่งโครงสร้างไกลแคนสำหรับการประยุกต์ใช้ทางการรักษาเฉพาะทางได้
• กลยุทธ์การวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการประเมินคุณภาพของไกลโคโปรตีน

ข้อได้เปรียบของการไกลโคซิเลชันของเซลล์ HEK293

เซลล์ไตของตัวอ่อนมนุษย์ 293 มีความสามารถในการเติมน้ำตาลที่แตกต่างกันซึ่งทำให้พวกมันแตกต่างจากระบบแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมชนิดอื่น ๆ ต่างจากเซลล์รังไข่ของหนูแฮมสเตอร์จีน (CHO) ที่ผลิตกรดไซอะลิกที่เชื่อมต่อแบบ α2,3 เท่านั้น เซลล์ HEK293 แสดงออกของเอนไซม์ไซอะลิททรานสเฟอเรสทั้งแบบ α2,3 และ α2,6 ทำให้เกิดโครงสร้างไกลแคนที่มีความคล้ายคลึงกับไกลโคโปรตีนของมนุษย์ตามธรรมชาติมากขึ้น

ความแตกต่างนี้มีนัยสำคัญทางการรักษาอย่างมาก ไกลโคโปรตีนในซีรั่มมนุษย์หลายชนิด รวมถึงอิมมูโนโกลบูลินและปัจจัยการแข็งตัวของเลือด มีสัดส่วนของกรดไซอัลิกที่เชื่อมต่อแบบ α2,6 อยู่มาก โปรตีนที่ใช้ในการรักษาที่ผลิตในเซลล์ HEK293 อาจมีลักษณะทางเภสัชจลนศาสตร์ที่ดีขึ้นและมีความเป็นภูมิคุ้มกันน้อยลงเมื่อเทียบกับโปรตีนที่ผลิตจากเซลล์ CHO

เซลล์ HEK293ของเรา(300192)เป็นจุดเริ่มต้นที่ยอดเยี่ยมสำหรับการผลิตไกลโคโปรตีน โดยมีลักษณะการเจริญเติบโตที่แข็งแกร่งในขณะที่ยังคงรักษาเครื่องจักรไกลโคซิเลชันตามธรรมชาติไว้ สำหรับการใช้งานที่ต้องการประสิทธิภาพการทรานส์เฟคชันที่ดีขึ้นเซลล์ HEK293Tของเรา(300189)ช่วยให้สามารถศึกษาการแสดงออกได้อย่างรวดเร็ว

การเผาผลาญน้ำตาลนิวคลีโอไทด์และวิศวกรรมสารตั้งต้น

ประสิทธิภาพของการเติมหมู่ไกลโคไซด์ขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของตัวบริจาคน้ำตาลนิวคลีโอไทด์ภายในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมและออร์แกเนลล์กอลจิเป็นหลักโมเลกุลน้ำตาลที่ถูกกระตุ้นเหล่านี้—รวมถึง UDP-กลูโคส, UDP-กาแลคโตส, UDP-N-อะเซทิลกลูโคซามีน, GDP-แมนโนส, GDP-ฟูกอส, และ CMP-ไซอะลิกแอซิด—ทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นสำหรับเอนไซม์ไกลโคซิทรานสเฟอเรสที่สร้างสายไกลแคน

วิธีการทางวิศวกรรมเมตาบอลิซึมสามารถเพิ่มปริมาณพูลของน้ำตาลนิวคลีโอไทด์ผ่านกลไกหลายประการ การเติมสารอาหารโดยตรงในอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยโมโนแซ็กคาไรด์ เช่น กาแล็กโทส แมนโนส หรือเอ็น-อะเซทิลแมนโนซามีน (ManNAc) จะให้สารตั้งต้นในเส้นทางซัลเวจที่เซลล์สามารถเปลี่ยนเป็นน้ำตาลนิวคลีโอไทด์ที่สอดคล้องกันได้ การเติม ManNAc ในปริมาณ 10-40 มิลลิโมลาร์ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถเพิ่มระดับไซอาลิเลชันอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ไลน์ต่างๆ

แนวทางทางพันธุกรรมให้ทางออกที่ถาวรกว่า การแสดงออกของเอนไซม์สำคัญในเส้นทางชีวสังเคราะห์น้ำตาลนิวคลีโอไทด์มากเกินไป—รวมถึง CMP-sialic acid synthetase, UDP-glucose pyrophosphorylase, หรือ GDP-mannose pyrophosphorylase—สามารถเพิ่มปริมาณสารตั้งต้นได้อย่างยั่งยืนโดยไม่ต้องเสริมในอาหารเลี้ยงเชื้อ

การปรับสภาพวัฒนธรรมเพื่อเพิ่มคุณภาพไกลแคน

พารามิเตอร์ทางสิ่งแวดล้อมมีผลกระทบอย่างลึกซึ้งต่อผลลัพธ์ของการไกลโคซิเลชัน ซึ่งบ่อยครั้งมีผลกระทบเทียบเท่ากับการดัดแปลงทางพันธุกรรมต่อโปรไฟล์ไกลแคน การลดอุณหภูมิจาก 37°C เป็น 32-34°C ในระหว่างขั้นตอนการผลิตได้แสดงให้เห็นอย่างสม่ำเสมอว่าช่วยเพิ่มการไซอะลิเลชัน ซึ่งน่าจะเกิดจากการรวมกันของเวลาพักของโปรตีนในโกลจิที่ยาวนานขึ้นและกิจกรรมของไซอะลิเดสที่ลดลง

ค่าความเป็นกรด-ด่าง (pH) ของวัฒนธรรมมีอิทธิพลต่อทั้งกิจกรรมของเอนไซม์ไกลโคซิเลทรานสเฟอเรส (glycosyltransferase) และความเสถียรของไกลแคน (glycan) การรักษาค่า pH ระหว่าง 6.8 ถึง 7.2 โดยทั่วไปจะช่วยให้เกิดการไกลโคซิเลชัน (glycosylation) ได้ดีที่สุด อย่างไรก็ตาม ค่าที่เหมาะสมที่สุดอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับโปรตีนเป้าหมายและโปรไฟล์ของไกลแคนที่ต้องการ ค่า pH ต่ำกว่า 6.5 อาจส่งเสริมการตัดกรดไซอะลิก (sialic acid) ซึ่งลดการเกิดไซอะลิเลชันที่ปลายสาย (terminal sialylation)

ระดับออกซิเจนที่ละลายในน้ำมีผลต่อกระบวนการเมตาบอลิซึมของเซลล์ และส่งผลต่อเนื่องต่อการเกิดไกลโคซิเลชัน ในขณะที่สภาวะขาดออกซิเจน (ต่ำกว่า 20% ของความอิ่มตัวของอากาศ) อาจทำให้การเจริญเติบโตของเซลล์และประสิทธิภาพการผลิตลดลง ระดับออกซิเจนปานกลาง (30-50% ของความอิ่มตัวของอากาศ) มักสนับสนุนการเกิดไกลโคซิเลชันที่แข็งแรง สภาวะออกซิเจนสูงเกินไปอาจก่อให้เกิดอนุมูลออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาซึ่งทำลายไกลโคโปรตีนหรือรบกวนกลไกการเกิดไกลโคซิเลชัน

DMEM:Ham's F12 (1:1) Medium (820400a)ของเราเป็นสูตรพื้นฐานที่ยอดเยี่ยมสำหรับการผลิตไกลโคโปรตีน โดยมีองค์ประกอบสารอาหารที่สมดุลซึ่งสนับสนุนทั้งการเจริญเติบโตของเซลล์และการประมวลผลหลังการแปลโปรตีน

วิศวกรรมพันธุกรรมเพื่อการปรับแต่งการเติมน้ำตาลเชิงเฉพาะ

เครื่องมือทางวิศวกรรมพันธุกรรมสมัยใหม่ช่วยให้สามารถปรับเปลี่ยนความสามารถในการเติมน้ำตาลของ HEK293 ได้อย่างแม่นยำ เพื่อผลิตโปรตีนที่มีโครงสร้างไกลแคนตามต้องการ เทคโนโลยี CRISPR/Cas9 ได้ปฏิวัติวงการนี้โดยเปิดโอกาสให้สามารถกำจัดยีนของเอนไซม์ไกลโคซิทรานสเฟอเรสเฉพาะเจาะจงได้อย่างมีประสิทธิภาพ หรือเพิ่มกิจกรรมของเอนไซม์ใหม่เข้าไปได้

แอนติบอดีที่ไม่มีฟุโคส (Afucosylated antibodies) เป็นตัวอย่างที่โดดเด่นของการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีการปรับแต่งโครงสร้างน้ำตาล (glycoengineering) การกำจัดยีน FUT8 ซึ่งทำหน้าที่สร้างเอนไซม์ α1,6-fucosyltransferase จะทำให้การเติมฟุโคสที่แกนหลักของน้ำตาล N-glycans หายไป แอนติบอดีที่ไม่มีฟุโคสแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้นอย่างมากในการทำลายเซลล์โดยอาศัยแอนติบอดี (antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) ซึ่งเป็นคุณสมบัติที่ต้องการสำหรับการรักษาโรคมะเร็ง

ในทางกลับกัน การแสดงออกของไกลโคซิทรานสเฟอเรสมากเกินไปสามารถเพิ่มการดัดแปลงเฉพาะได้การแนะนำ β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnT-III) จะสร้างแอนติบอดีที่มี N-acetylglucosamine แบบตัดครึ่ง ซึ่งเป็นอีกหนึ่งการดัดแปลงที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มประสิทธิภาพของเอฟเฟกเตอร์ การแสดงออกของ galactosyltransferases และ sialyltransferases ที่มากเกินไปจะเพิ่มการปิดปลายไกลแคน ซึ่งอาจช่วยเพิ่มครึ่งชีวิตในซีรั่ม

สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอยที่สนับสนุนการผลิตไกลโคโปรตีนในปริมาณมาก เซลล์HEK293 ที่ปรับให้เหมาะสมกับการเพาะเลี้ยงแบบแขวนลอย (300686)ของเราสามารถถูกดัดแปลงเพิ่มเติมเพื่อรวมการดัดแปลงไกลโคซิเลชันตามที่ต้องการได้

กลยุทธ์เชิงวิเคราะห์สำหรับการประเมินการเติมหมู่ไกลโคซิล

การวิเคราะห์ลักษณะของไกลแคนอย่างครอบคลุมจำเป็นต้องใช้วิธีการวิเคราะห์หลายวิธีร่วมกัน การวิเคราะห์ไกลแคนที่ถูกปล่อยออกมาโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวแบบปฏิสัมพันธ์กับน้ำ (HILIC) ร่วมกับการตรวจจับด้วยฟลูออเรสเซนซ์ช่วยให้สามารถสร้างโปรไฟล์ไกลแคนได้อย่างละเอียดและมีความไวสูงมาก การวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโตรเมตรีช่วยยืนยันโครงสร้างและสามารถระบุการดัดแปลงที่ไม่คาดคิดได้

การวิเคราะห์การไกลโคซิเลชันเฉพาะตำแหน่งช่วยแก้ไขความไม่สม่ำเสมอที่มีอยู่ในไกลโคโปรตีน การทำแผนที่ไกลโคเพปไทด์โดยใช้ LC-MS/MS เผยให้เห็นทั้งการครอบครองของตำแหน่งไกลโคซิเลชันแต่ละตำแหน่งและโครงสร้างไกลแคนที่มีอยู่ในแต่ละตำแหน่ง ข้อมูลนี้มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการทำความเข้าใจความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและการทำงาน รวมถึงการรับประกันความสม่ำเสมอระหว่างแต่ละชุดการผลิต

วิธีการคัดกรองอย่างรวดเร็วช่วยสนับสนุนการพัฒนาและควบคุมคุณภาพของกระบวนการ การทดสอบที่ใช้เลคติน, การแยกสารด้วยไฟฟ้าผ่านหลอดแคปิลลารี, และแอนติบอดีที่จำเพาะต่อไกลแคน ช่วยให้สามารถประเมินคุณลักษณะสำคัญของไกลแคนได้อย่างมีประสิทธิภาพสูงโดยไม่ต้องเตรียมตัวอย่างอย่างละเอียด

ผลิตภัณฑ์ที่แนะนำสำหรับการผลิตไกลโคโปรตีน:

• เซลล์ HEK293 (300192)- รูปแบบการเติมน้ำตาลตามธรรมชาติของมนุษย์
• เซลล์ HEK293T (300189)- ประสิทธิภาพการถ่ายโอนยีนสูงสำหรับการศึกษาอย่างรวดเร็ว
• HEK293 ที่ปรับให้เข้ากับการแขวนลอย (300686)- แพลตฟอร์มการผลิตที่สามารถปรับขนาดได้
• DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a)- ปรับปรุงเพื่อเพิ่มการผลิตไกลโคโปรตีน