Кріоконсервування флуоресцентних клітин

Кріоконсервування флуоресцентних клітин

Збереження флуоресцентних клітин вимагає ретельного підходу як до процесу кріоконсервування, так і до підтримки стабільності флуоресцентного білка. Компанія Cytion розробила оптимізовані протоколи, які гарантують, що ваші флуоресцентно-мічені клітини збережуть життєздатність та інтенсивність флуоресценції після розморожування.

Стабільність флуоресцентних білків під час кріоконсервування

Флуоресцентні білки, зокрема GFP та його різновиди, демонструють надзвичайну стабільність під час належних процедур кріоконсервування. Наші дослідження в Cytion, зокрема з такими клітинними лініями, як клітини HK EGFP-альфа-тубулін/H2B-mCherry Cells і HK EGFP-H2B Cells, показують, що флуоресцентні білки зберігають свою структурну цілісність при заморожуванні в оптимальних умовах. Ключ до успішного збереження полягає у використанні відповідних кріопротекторів та дотриманні стандартизованих протоколів. Ми рекомендуємо використовувати середовище для заморожування CM-1, яке було спеціально розроблено для захисту клітинних структур і збереження стабільності білків під час заморожування. При використанні належних методів кріоконсервування експресія флуоресцентних білків після розморожування, як правило, залишається на рівні вище 90% від рівня до заморожування.

Важливість складу заморожувального середовища для збереження флуоресценції

Склад середовища для заморожування відіграє вирішальну роль у збереженні життєздатності клітин та інтенсивності флуоресценції. Компанія Cytion розробила спеціалізовані середовища для кріоконсервування, які вирішують унікальні завдання збереження флуоресцентних клітин. Наше середовище для заморожування CM-ACF, що не містить сироватки, було спеціально оптимізовано для захисту флуоресцентних білків під час процесу заморожування. Для чутливих флуоресцентних клітинних ліній, таких як клітини HK EGFP-Cap-D2, ми рекомендуємо використовувати наше середовище для заморожування CM-1 - 100 мл, яке містить оптимізовані концентрації кріопротекторів, що запобігають утворенню кристалів льоду, зберігаючи при цьому стабільність флуорофора. Збалансована осмолярність середовища та захисні речовини гарантують, що флуоресцентні білки зберігають свою нативну конформацію протягом усього процесу заморожування і відтавання, що призводить до стабільних флуоресцентних сигналів після відтавання.

Заморожування з контрольованою швидкістю: Важливо для збереження флуоресценції

Заморожування з контрольованою швидкістю має вирішальне значення для збереження цілісності флуоресцентних білків під час кріоконсервування. Наші дослідження з флуоресцентними клітинними лініями, такими як NRK-EGFP-H2B Cells і U2OS-CRISPR-NUP96-SNAP clone no.33 Cells, демонструють, що швидкість охолодження -1°C за хвилину є оптимальною для збереження інтенсивності флуоресценції. Цей контрольований підхід у поєднанні з нашим середовищем для заморожування CM-ACF - безсироватковий - 100 мл мінімізує утворення шкідливих кристалів льоду, які можуть вплинути на структуру білка. Ми рекомендуємо використовувати контейнер для заморожування ізопропанолу або програмований морозильник для досягнення стабільної швидкості охолодження. Цей метод виявився особливо ефективним для збереження складних флуоресцентних конфігурацій білків, таких як ті, що містяться в наших клітинах HK EGFP-LaminA/H2B-mCherry Cells.

Особливості поводження з клітинами, що експресують GFP та RFP

Різні флуоресцентні білки потребують специфічних підходів для оптимального збереження. З нашого досвіду роботи в Cytion з такими клітинами, як клітини HK EGFP-LaminB1/H2B-mCherry Cells, варіанти GFP, як правило, більш стабільні під час кріоконсервування, ніж варіанти RFP. Для клітин, що експресують GFP, ми рекомендуємо використовувати наше середовище для заморожування CM-ACF - без сироватки - 100 мл, яке забезпечує чудовий захист структури флуорофора. Клітини, що експресують RFP, такі як наші клітини HK-CRISPR-Pom121-mCherry #32, виграють від додавання антиоксидантів до середовища для заморожування для запобігання деградації флуорофора. Основні відмінності в обробці включають в себе наступні:

• Клітини, що експресують GFP: Стандартна швидкість охолодження (-1°C/хв) з безсироватковим середовищем
• Клітини, що експресують RFP: Дещо швидша швидкість охолодження (-1,5°C/хв) у середовищі з додаванням антиоксидантів
• Обидва типи: Мінімальний вплив світла під час маніпуляцій
• Захист від коливань рН під час процесу заморожування

Періоди відновлення після розморожування та оцінка флуоресценції

Після кріоконсервування флуоресцентні клітини потребують певного періоду відновлення для відновлення оптимальної інтенсивності флуоресценції. Наші дослідження з клітинами HEK293, що експресують флуоресцентні білки, показали, що 24-48 годинний період відновлення є вирішальним. Протягом цього часу клітини повинні знаходитись у повноцінному живильному середовищі, доповненому стандартними антибіотиками. Ми спостерігали, що інтенсивність флуоресценції зазвичай досягає свого піку приблизно через 72 години після розморожування, особливо в клітинних лініях, таких як HEK293T, що експресують варіанти GFP.

Оптимізація стратегії збереження флуоресцентних клітин

Успіх у збереженні флуоресцентних клітин залежить від комплексного підходу до кріоконсервування. У Cytion ми рекомендуємо використовувати наше середовище для заморожування CM-1 у поєднанні з протоколами заморожування з контрольованою швидкістю. Регулярна перевірка збереження флуоресценції за допомогою проточної цитометрії або флуоресцентної мікроскопії забезпечує стабільність результатів. Для спеціалізованих застосувань наша команда технічної підтримки може надати індивідуальні протоколи, пристосовані до ваших конкретних флуоресцентних клітинних ліній. Пам'ятайте, що правильне поводження протягом усього процесу - від підготовки до заморожування до відновлення після розморожування - має важливе значення для збереження життєздатності клітин та інтенсивності флуоресценції. Довіртеся досвіду і продуктам Cytion, які допоможуть вам досягти оптимальних результатів у збереженні флуоресцентних клітин.