Dental Pulp Stem Cells: Isolation, Culture, and Therapeutic Applications

牙髓干细胞：牙髓干细胞的分离、培养和治疗应用

牙髓干细胞（DPSCs）是多能间充质干细胞的现成来源，具有巨大的再生医学潜力。牙髓干细胞是从牙齿内的软组织中分离出来的，可以从拔出的牙齿（包括牙科手术中常规拔除的智齿）中非侵入性地获得。这些细胞具有分化成多系细胞的能力，包括牙骨母细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和类神经细胞，使它们成为从牙科再生到神经修复等各种治疗应用的理想候选细胞。

主要启示

• 可通过酶解或外植体培养方法从拔出的牙齿中分离出 DPSCs
• 这些细胞表达间充质干细胞标记（CD73、CD90、CD105），但缺乏造血标记
• DPSCs 具有向成骨、成脂、软骨和神经源系多能分化的能力
• 最佳培养条件可在增殖能力与干细胞特性保持之间取得平衡
• 治疗应用包括牙齿再生、骨修复和神经疾病治疗

牙髓干细胞的分离方法

牙髓干细胞分离有两种主要方法：酶消化法和外植体（生长）培养法。酶解法利用 I 型胶原酶和分散酶将牙髓组织解离成单细胞悬浮液，可获得较高的初始细胞数量，但可能会影响细胞表面标记。外植体培养包括粉碎牙髓组织，让细胞从组织碎片中迁移，产生的细胞可能更好地保存了干细胞特性，但初始产量较低。

酶解方案首先用机械方法从牙冠和牙根中提取牙髓组织。在含抗生素的磷酸盐缓冲盐水中清洗后，将牙髓切碎，并在37°C下用I型胶原酶（3毫克/毫升）和dispase（4毫克/毫升）溶液培养1-2小时。得到的细胞悬浮液通过 70 μm 过滤器过滤，离心，然后培养在适当的培养基中。

人类牙髓干细胞（hDPSC）可作为特性化、低温保存的制备物用于研究应用。对于寻求相关牙科干细胞群的研究人员来说，人牙龈毛囊干细胞（hDFSC）提供了另一种具有独特分化特性的来源。这些市售细胞可提供标准化的起始材料，并有质量指标记录。

培养基优化

标准的 DPSC 培养采用α-改良老鹰培养基（α-MEM）或杜氏改良老鹰培养基（DMEM），辅以 10-20% 的胎牛血清和抗生素。培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，5-10 ng/mL）可促进增殖，同时可能影响分化能力。快速扩增与维持干细胞特性之间的平衡指导着培养基的选择。

无血清培养系统可减少临床应用中的批次间差异和异种成分暴露。定义的无血清培养基含有特定的生长因子、胰岛素、转铁蛋白和硒，可保持 DPSC 的增殖和分化潜力。从含血清过渡到无血清条件需要逐步适应，以防止细胞应激。

DMEM为 DPSC 培养提供了标准基础培养基。DMEM/Ham's F12组合提供了一些研究者偏爱的改良营养配比。冷冻培养基 CM-1可用于特征 DPSC 储存的冷冻保存，而无血清冷冻培养基 CM-ACF则支持临床级的储存方案。

表征和质量控制

国际细胞治疗学会（ISCT）标准规定了间充质干细胞表征的最低标准。DPSC 必须在标准培养条件下表现出塑性粘附性，表达特定的表面标记（CD73、CD90、CD105 阳性；CD34、CD45、HLA-DR 阴性），以及向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的三系分化能力。这些标准确定了 DPSC 的身份，并将其与其他细胞群区分开来。

流式细胞术可对 DPSC 群体的表面标记表达进行定量评估。超过 95% 的细胞应表达阳性标记，而表达造血标记的细胞应少于 2%。表面标记的情况可能会因供体年龄、牙齿类型（脱落牙与恒牙）和通过数而异，这就强调了标准化表征方案的重要性。

集落形成单位测定可量化DPSC制备物中的干细胞频率。以克隆密度培养的单细胞显示出不同的集落形成能力，反映了原代分离物的异质性。根据分离方法和培养条件的不同，集落形成效率通常在20-80%之间，通过率越高，效率越低，表明干细胞耗竭。

多线分化方案

成骨分化采用标准诱导培养基，基础培养基中含有地塞米松（10 nM）、β-甘油磷酸酯（10 mM）和抗坏血酸（50 μg/mL）。诱导 14-21 天后，茜素红或 von Kossa 染色可检测到矿化基质沉积，成骨基因表达（RUNX2、骨钙素、骨素）证实了分化。DPSC 的成骨能力是骨组织工程和牙齿再生应用的基础。

利用含有地塞米松（1 μM）、胰岛素（10 μg/mL）、吲哚美辛（200 μM）和 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（0.5 mM）的培养基进行成脂分化。油红 O 染色法可观察到 14-21 天后脂滴的积累。DPSC的成脂能力通常低于骨髓间充质干细胞，这反映了它们的神经嵴发育起源。

由于神经嵴起源，神经源分化将DPSC与其他间充质干细胞来源区分开来。使用神经营养因子（BDNF、NGF、NT-3）和维甲酸的诱导方案可促进神经样形态和神经元标志物（β-III 管蛋白、NeuN、MAP2）的表达。这种神经源潜能支持在神经退行性疾病治疗和神经再生方面的应用。

与其他间充质干细胞来源的比较

与骨髓间充质干细胞相比，DPSCs 具有多项优势，包括无创采集、增殖率更高以及神经源潜力更强。然而，骨髓间充质干细胞在许多治疗应用中仍具有更好的特性，并拥有更广泛的临床安全性数据。直接比较 DPSC 和骨髓间充质干细胞在不同应用中的性能，可指导针对特定治疗目标的来源选择。

人间质干细胞-骨髓（HMSC-BM）为比较研究提供了黄金标准的间充质干细胞来源。人类间充质干细胞--脂肪组织提供了另一种具有独特特性的来源。来自脐带的人类间充质干细胞-沃顿果冻是一种更年轻的间充质干细胞来源，具有潜在的增强效力。

来自人类脱落牙齿（SHED）的干细胞代表了一种相关的牙科干细胞群体，其增殖率高于恒牙来源的 DPSCs。乳牙的自然脱落为儿科干细胞库提供了一个非侵入性收集机会。与成人 DPSCs 相比，SHED 表现出更强的成骨性和牙源性分化能力。

治疗应用

牙齿再生是 DPSC 最直接的应用，可利用其牙本质分化能力。临床前研究证明了 DPSC 介导的牙本质形成、牙髓组织再生和全齿结构发育。评估自体 DPSC 植入牙髓再生的临床试验显示，在牙髓坏死的成熟恒牙中取得了良好的效果。

骨组织工程应用利用 DPSC 的成骨能力，用于颅颌面和骨科适应症。播种在生物相容性支架上的 DPSC 可在体内生成矿化骨组织。与中胚层间充质干细胞相比，DPSCs 的颅神经嵴来源可能为颅面骨再生提供优势。

神经学应用可利用 DPSC 的神经源潜力和神经营养因子分泌。临床前研究表明，DPSC 可改善中风、脊髓损伤和周围神经损伤模型。其机制包括细胞替代和通过分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子和其他神经营养素产生的旁分泌效应。

质量保证和储存

长期储存 DPSC 需要标准化的方案，以确保解冻后细胞的存活率和功能。使用含 DMSO 的冷冻保存介质进行控速冷冻可在冷冻和储存期间保护细胞。细胞解冻后的存活率超过 80%，表面标记表达得以保持，这证明冷冻保存取得了成功。

通过 STR 图谱对细胞系进行鉴定，确定供体身份，并区分来自不同个体的 DPSC 制剂。支原体检测可确保整个扩增和储存过程中培养物的完整性。这些质量控制措施对于临床级 DPSC 制备至关重要。

传代次数记录可追踪累积的群体倍增，并可在不同实验中进行比较。DPSC在大约3-7个传代期间保持干细胞特性，在更高传代时出现衰老标记。将早期细胞储存起来，可为将来的使用保留治疗潜力。

结论

牙髓干细胞是一种易于获取的多能干细胞来源，具有巨大的治疗潜力。标准化的分离、培养和表征方案可确保研究和临床应用中细胞质量的一致性。DPSCs 独特的神经嵴起源提供了不同于其他间充质干细胞来源的分化能力，特别是向神经源系分化的能力。持续的临床开发将使 DPSCs 成为再生医学应用中的重要工具，应用范围涵盖牙科、骨骼和神经系统。