Dental Pulp Stem Cells: Isolation, Culture, and Therapeutic Applications

Zobu celulozes cilmes šūnas: Izolēšana, kultivēšana un terapeitiskie pielietojumi

Zobu celulpas cilmes šūnas (DPSC) ir viegli pieejams multipotento mezenhīma cilmes šūnu avots ar ievērojamu reģeneratīvās medicīnas potenciālu. Izolētas no zobu mīkstajiem audiem, DPSC var iegūt neinvazīvā veidā no izrautiem zobiem, tostarp gudrības zobiem, ko parasti izņem zobārstniecības procedūru laikā. Šīm šūnām piemīt spēja diferencēties vairākās līnijās, tostarp odontoblastos, osteoblastos, adipocītos, hondrocītos un nerviem līdzīgās šūnās, padarot tās par pievilcīgām kandidātēm dažādiem terapeitiskiem lietojumiem, sākot no zobu reģenerācijas līdz neiroloģiskai atjaunošanai.

Galvenie secinājumi

• DPSC var izolēt no ekstrahētiem zobiem, izmantojot fermentatīvās šķelšanas vai eksplanta kultūras metodes
• Šīs šūnas ekspresē mezenhimālo cilmes šūnu marķierus (CD73, CD90, CD105), bet tām nav hematopoētisko marķieru
• DPSC izrāda multipotentas diferenciācijas spēju osteogēnā, adipogēnā, hondrogēnā un neirogēnā virzienā
• Optimāli kultivēšanas apstākļi līdzsvaro proliferācijas spēju un cilmes šūnu īpašību saglabāšanu
• Terapeitiskie lietojumi aptver zobu reģenerāciju, kaulu atjaunošanu un neiroloģisku slimību ārstēšanu

Zobu celulozes cilmes šūnu izdalīšanas metodes

Pastāv divas galvenās DPSC izolēšanas metodes: fermentatīvā šķelšana un eksplanāta (izauguma) kultivēšana. Enzimātiskajā šķelšanā izmanto I tipa kolagenāzi un dispāzi, lai disociētu celulozes audus vienšūnu suspensijās, tādējādi iegūstot lielāku sākotnējo šūnu skaitu, bet, iespējams, ietekmējot šūnu virsmas marķierus. Eksplanta kultūrā celulozes audus sasmalcina un ļauj šūnām migrēt no audu fragmentiem, iegūstot šūnas ar potenciāli labāk saglabātām cilmes šūnu īpašībām, bet ar mazāku sākotnējo daudzumu.

Fermentatīvās šķelšanas protokols sākas ar celulozes audu mehānisku ekstrakciju no zoba vainaga un saknes. Pēc mazgāšanas ar fosfātu buferšķīdinātu fizioloģisko šķīdumu ar antibiotikām mīkstumu sasmalcina un inkubē I tipa kolagenāzes (3 mg/ml) un dispāzes (4 mg/ml) šķīdumā 1-2 stundas 37 °C temperatūrā. Iegūto šūnu suspensiju filtrē caur 70 μm sietiņu, centrifugē un izkliedē atbilstošā barotnē.

Cilvēka zobu celulozes cilmes šūnas (hDPSC ) ir pieejamas kā raksturoti, kriokonservēti preparāti, kas gatavi izmantošanai pētniecībā. Pētniekiem, kas meklē radniecīgas zobu cilmes šūnu populācijas, cilvēka zobu folikulu cilmes šūnas (hDFSC ) ir alternatīvs avots ar atšķirīgām diferenciācijas īpašībām. Šīs komerciāli pieejamās šūnas piedāvā standartizētu izejmateriālu ar dokumentētiem kvalitātes rādītājiem.

Kultūras barotnes optimizācija

Standarta DPSC kultūrā izmanto alfa modificētu Eagle barotni (α-MEM) vai Dulbekko modificētu Eagle barotni (DMEM), kas papildināta ar 10-20 % liellopu augļa seruma un antibiotikām. Barotnes papildināšana ar bāzes fibroblastu augšanas faktoru (bFGF, 5-10 ng/ml) veicina proliferāciju, vienlaikus potenciāli ietekmējot diferenciācijas spēju. Barotnes izvēli nosaka līdzsvars starp strauju paplašināšanos un cilmes šūnu īpašību saglabāšanu.

Kultūras sistēmas bez seruma samazina sērijas mainīgumu un ksenogēno komponentu iedarbību klīniskiem lietojumiem. Noteiktas bezseruma barotnes, kas satur specifiskus augšanas faktorus, insulīnu, transferīnu un selēnu, saglabā DPSC proliferācijas un diferenciācijas potenciālu. Pārejai no serumu saturošiem uz bezseruma apstākļiem nepieciešama pakāpeniska pielāgošanās, lai novērstu šūnu stresu.

DMEM ir standarta bāzes barotne DPSC kultivēšanai. DMEM/Ham's F12 kombinācijas piedāvā modificētu barības vielu attiecību, ko izvēlas daži pētnieki. Saldēšanas barotne CM-1 ļauj veikt raksturoto DPSC krājumu kriokonservēšanu, bet bezseruma saldēšanas barotne CM-ACF atbalsta klīniskās kvalitātes banku protokolus.

Raksturošana un kvalitātes kontrole

Starptautiskās šūnu terapijas biedrības (ISCT) kritēriji nosaka minimālos mezenhimālo cilmes šūnu raksturošanas standartus. DPSC standarta kultivēšanas apstākļos jāuzrāda plastiska adherence, specifisku virsmas marķieru ekspresija (CD73, CD90, CD105 pozitīvi; CD34, CD45, HLA-DR negatīvi) un trīslīniju diferenciācijas spēja uz osteoblastiem, adipocītiem un hondrocītiem. Šie kritēriji nosaka DPSC identitāti un atšķir tos no citām šūnu populācijām.

Plūsmas citometrija ļauj kvantitatīvi novērtēt virsmas marķieru ekspresiju visās DPSC populācijās. Vairāk nekā 95 % šūnu vajadzētu būt pozitīvu marķieru ekspresijai, bet mazāk nekā 2 % - hematopoētisko marķieru ekspresijai. Virsmas marķieru profili var atšķirties atkarībā no donora vecuma, zobu tipa (piena un pastāvīgie zobi) un pasāžas skaita, tādējādi uzsverot standartizētu raksturošanas protokolu nozīmi.

Koloniju veidojošo vienību testi kvantitatīvi nosaka cilmes šūnu biežumu DPSC preparātos. Atsevišķas šūnas, kas izkliedētas ar klonu blīvumu, uzrāda atšķirīgu spēju veidot kolonijas, atspoguļojot heterogenitāti primāro izolātu ietvaros. Koloniju veidošanas efektivitāte parasti ir 20-80 % atkarībā no izolēšanas metodes un audzēšanas apstākļiem, un efektivitāte samazinās pie lielāka pasāžas skaita, kas norāda uz cilmes šūnu izsmelšanu.

Daudzlīniju diferenciācijas protokoli

Osteogēnai diferenciācijai izmanto standarta indukcijas barotni, kas satur deksametazonu (10 nM), β-glicerofosfātu (10 mM) un askorbīnskābi (50 μg/ml) pamatvielā. Pēc 14-21 dienas pēc indukcijas ar Alizarin Red vai von Kossa krāsojumu nosaka mineralizētā matriksa izgulsnēšanos, un osteogēno gēnu ekspresija (RUNX2, osteokalcīns, osteopontīns) apstiprina diferenciāciju. DPSC osteogēnās spējas ir pamats to izmantošanai kaulu audu inženierijā un zobu reģenerācijā.

Adipogēnai diferenciācijai izmanto barotni, kas satur deksametazonu (1 μM), insulīnu (10 μg/ml), indometacīnu (200 μM) un 3-izobutil-1metilksantīnu (0,5 mM). Lipīdu pilienu uzkrāšanos pēc 14-21 dienas vizualizē, izmantojot Oil Red O krāsojumu. DPSC adipogēnās spējas parasti ir zemākas nekā kaulu smadzeņu MSC, kas atspoguļo to nervu kores attīstības izcelsmi.

Neirogēnā diferenciācija atšķir DPSC no citiem MSC avotiem, pateicoties to nervu kores izcelsmei. Indukcijas protokoli, kuros izmanto neirotrofiskos faktorus (BDNF, NGF, NT-3) un retinoīnskābi, veicina neironiem līdzīgu morfoloģiju un neironu marķieru (β-III tubulīna, NeuN, MAP2) ekspresiju. Šis neirogēniskais potenciāls ir izmantojams neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanā un nervu reģenerācijā.

Salīdzinājums ar citiem mezenhimālo cilmes šūnu avotiem

DPSC piedāvā vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar kaulu smadzeņu MSC, tostarp neinvazīvu iegūšanu, augstāku proliferācijas ātrumu un lielāku neirogēno potenciālu. Tomēr kaulu smadzeņu MSC joprojām ir labāk raksturotas daudziem terapeitiskiem lietojumiem, un par to klīnisko drošību ir vairāk datu. DPSC un BM-MSC veiktspējas tiešs salīdzinājums dažādiem lietojumiem palīdz izvēlēties avotu konkrētiem terapeitiskiem mērķiem.

Cilvēka mezenhimālās cilmes šūnas - kaulu smadzenes (HMSC-BM) ir zelta standarta MSC avots salīdzināšanas pētījumiem. Cilvēka mezenhimālās cilmes šūnas - taukaudi ir vēl viens pieejams avots ar atšķirīgām īpašībām. Cilvēka mezenhimālās cilmes šūnas - Vartona želeja no nabassaites - ir jaunāks MSC avots ar potenciāli lielāku iedarbību.

Cilmes šūnas no cilvēka lobītiem piena zobiem (SHED) ir radniecīga zobu cilmes šūnu populācija ar augstāku proliferācijas līmeni nekā no pastāvīgajiem zobiem iegūtas DPSC. Dabiskā lapu zobu eksfoliācija nodrošina neinvazīvu iegūšanas iespēju pediatrisko cilmes šūnu banku darbībai. SHED uzrāda pastiprinātu osteogēnisku un odontogēnu diferenciāciju salīdzinājumā ar pieaugušo DPSC.

Terapeitiskie lietojumi

Zobu reģenerācija ir vistiešākais DPSC pielietojums, izmantojot to odontogēnās diferenciācijas spēju. Preklīniskie pētījumi liecina par DPSC mediētu dentīna veidošanos, pulpas audu reģenerāciju un visa zoba struktūras attīstību. Klīniskajos pētījumos, kuros novērtē autologu DPSC implantāciju celulozes reģenerācijai, ir gūti daudzsološi rezultāti nobriedušiem pastāvīgajiem zobiem ar nekrotisku celulozi.

Kaulu audu inženierijas lietojumos tiek izmantotas DPSC osteogēnās spējas kraniofaciālām un ortopēdiskām indikācijām. DPSC, kas izkliedēti uz biosaderīgiem skeletiem, veido mineralizētus kaulaudus in vivo. DPSCs galvaskausa nervu kores izcelsme var sniegt priekšrocības galvaskausa kaulu reģenerācijai salīdzinājumā ar mezodermas izcelsmes MSCs.

Neiroloģijā izmanto DPSC neirogēno potenciālu un neirotrofisko faktoru sekrēciju. Preklīniskie pētījumi liecina par DPSC mediētiem uzlabojumiem insulta, muguras smadzeņu bojājumu un perifēro nervu bojājumu modeļos. Mehānisms ietver gan šūnu aizvietošanu, gan parakrīno iedarbību, izdalot nervu augšanas faktoru, smadzeņu izcelsmes neirotrofisko faktoru un citus neirotrofīnus.

Kvalitātes nodrošināšana un banku darbība

Ilgtermiņa DPSC banku darbībai nepieciešami standartizēti protokoli, kas nodrošina šūnu dzīvotspēju un darbību pēc atkausēšanas. Kontrolēta ātruma sasaldēšana ar DMSO saturošu kriokonservēšanas vidi aizsargā šūnas sasaldēšanas un uzglabāšanas laikā. Dzīvotspēja pēc atkausēšanas, kas pārsniedz 80 %, un virsmas marķieru ekspresijas saglabāšana apstiprina veiksmīgu kriokonservēšanu.

Šūnu līnijas autentifikācija, izmantojot STR profilēšanu, nosaka donora identitāti un ļauj atšķirt DPSC preparātus no dažādām personām. Mikoplazmas testēšana nodrošina kultūras integritāti visā ekspansijas un uzglabāšanas procedūras laikā. Šie kvalitātes kontroles pasākumi ir būtiski klīniskas kvalitātes DPSC sagatavošanai.

Pasāžas skaita dokumentācija ļauj izsekot kumulatīvajam populācijas dubultošanās skaitam un salīdzināt eksperimentus. DPSC saglabā cilmes šūnu īpašības aptuveni 3.-7. pasāžā, bet vecumstruktūras marķieri parādās augstākajās pasāžās. Agrīno pāreju krājumu uzglabāšana saglabā terapeitisko potenciālu turpmākai izmantošanai.

Secinājumi

Zobu celulozes cilmes šūnas ir viegli pieejams, multipotents cilmes šūnu avots ar ievērojamu terapeitisko potenciālu. Standartizēti izolēšanas, kultivēšanas un raksturošanas protokoli nodrošina nemainīgu šūnu kvalitāti gan pētniecībā, gan klīniskajā praksē. DPSC unikālā nervu kores izcelsme nodrošina diferenciācijas iespējas, kas atšķiras no citiem MSC avotiem, jo īpaši attiecībā uz neirogēnām līnijām. Turpinot klīnisko attīstību, DPSC kļūs par vērtīgiem instrumentiem reģeneratīvās medicīnas lietojumos, kas aptver zobārstniecības, skeleta un neiroloģijas indikācijas.