Dental Pulp Stem Cells: Isolation, Culture, and Therapeutic Applications

Dantų minkštimo kamieninės ląstelės: Stemplės: išskyrimas, kultivavimas ir terapinis pritaikymas

Dantų pulpos kamieninės ląstelės (DPSC) yra lengvai prieinamas multipotentinių mezenchiminių kamieninių ląstelių šaltinis, turintis didelį regeneracinės medicinos potencialą. DPSC, išskirtos iš dantų minkštųjų audinių, gali būti gaunamos neinvaziniu būdu iš pašalintų dantų, įskaitant išminties dantis, kurie įprastai šalinami atliekant odontologines procedūras. Šios ląstelės pasižymi gebėjimu diferencijuotis į įvairias linijas, įskaitant odontoblastus, osteoblastus, adipocitus, chondrocitus ir į nervus panašias ląsteles, todėl jos yra patrauklios kandidatės įvairioms terapinėms reikmėms - nuo dantų regeneracijos iki neurologinio atstatymo.

Pagrindinės išvados

• DPSC galima išskirti iš ištrauktų dantų taikant fermentinio virškinimo arba eksplantų auginimo metodus
• Šios ląstelės išreiškia mezenchiminių kamieninių ląstelių žymenis (CD73, CD90, CD105), tačiau neturi kraujodaros žymenų
• DPSC pasižymi multipotentinio diferencijavimo gebėjimu į osteogeninę, adipogeninę, chondrogeninę ir neurogeninę linijas
• Optimalios auginimo sąlygos subalansuoja proliferacijos gebėjimą ir kamieninių ląstelių savybių išlaikymą
• Terapinis pritaikymas apima dantų regeneraciją, kaulų atstatymą ir neurologinių ligų gydymą

Dantų minkštimo kamieninių ląstelių išskyrimo metodai

Egzistuoja du pagrindiniai DPSC išskyrimo metodai: fermentinis skaidymas ir eksplantų (ataugų) auginimas. Fermentinio skaidymo metu I tipo kolagenazė ir dispazė disocijuoja pulpos audinį į pavienių ląstelių suspensijas, todėl gaunamas didesnis pradinis ląstelių skaičius, tačiau gali būti pažeisti ląstelių paviršiaus žymenys. Eksplantų kultūra apima pulpos audinio smulkinimą ir ląstelių migravimą iš audinio fragmentų, taip gaunamos ląstelės, kurių kamieninių ląstelių savybės gali išlikti geresnės, tačiau pradinis ląstelių kiekis yra mažesnis.

Fermentinio skaidymo protokolas pradedamas nuo mechaninio pulpos audinio ištraukimo iš danties vainiko ir šaknies. Po plovimo fosfato buferiniame druskos tirpale su antibiotikais pulpa susmulkinama ir 1-2 valandas 37 °C temperatūroje inkubuojama I tipo kolagenazės (3 mg/ml) ir dispazės (4 mg/ml) tirpale. Gauta ląstelių suspensija filtruojama per 70 μm filtrą, centrifuguojama ir įterpiama į atitinkamą mitybinę terpę.

Žmogaus dantų minkštimo kamieninės ląstelės (hDPSC ) tiekiamos kaip charakterizuoti, kriokonservuoti preparatai, paruošti naudoti moksliniams tyrimams. Tyrėjams, ieškantiems giminingų dantų kamieninių ląstelių populiacijų, žmogaus dantų folikulų kamieninės ląstelės (hDFSC ) yra alternatyvus šaltinis, pasižymintis skirtingomis diferenciacijos savybėmis. Šios komerciškai prieinamos ląstelės yra standartizuota pradinė medžiaga su dokumentais patvirtintais kokybės rodikliais.

Kultūros terpės optimizavimas

Standartinei DPSC kultūrai naudojama alfa modifikuota Eagle's terpė (α-MEM) arba Dulbecco modifikuota Eagle's terpė (DMEM), papildyta 10-20 % galvijų vaisiaus serumo ir antibiotikais. Terpės papildymas pagrindiniu fibroblastų augimo faktoriumi (bFGF, 5-10 ng/ml) padidina proliferaciją, tačiau gali turėti įtakos diferenciacijos gebėjimui. Parenkant terpę vadovaujamasi pusiausvyra tarp greito plėtimosi ir kamieninių ląstelių savybių išlaikymo.

Serumo neturinčios kultūrų sistemos sumažina atskirų partijų kintamumą ir ksenogeninių komponentų poveikį klinikinėms reikmėms. Nustatytos terpės be serumo, kuriose yra specifinių augimo veiksnių, insulino, transferino ir seleno, palaiko DPSC proliferacijos ir diferenciacijos potencialą. Perėjimas nuo serumo turinčių sąlygų prie sąlygų be serumo reikalauja laipsniško prisitaikymo, kad būtų išvengta ląstelių streso.

DMEM yra standartinė bazinė terpė DPSC auginti. Kai kurių tyrėjų pageidaujami DMEM ir Ham's F12 deriniai siūlo modifikuotą maistinių medžiagų santykį. CM-1 užšaldymo terpė leidžia kriokonservuoti charakterizuotas DPSC atsargas, o užšaldymo terpė be serumo CM-ACF palaiko klinikinio lygio bankininkystės protokolus.

Charakterizavimas ir kokybės kontrolė

Tarptautinės ląstelių terapijos draugijos (ISCT) kriterijai apibrėžia minimalius mezenchiminių kamieninių ląstelių apibūdinimo standartus. DPSC turi pasižymėti plastiniu lipnumu standartinėmis kultūros sąlygomis, specifinių paviršiaus žymenų raiška (CD73, CD90, CD105 teigiami; CD34, CD45, HLA-DR neigiami) ir gebėjimu diferencijuotis į osteoblastus, adipocitus ir chondrocitus. Pagal šiuos kriterijus nustatoma DPSC tapatybė ir jie atskiriami nuo kitų ląstelių populiacijų.

Srauto citometrija leidžia kiekybiškai įvertinti DPSC populiacijų paviršiaus žymenų raišką. Daugiau kaip 95 % ląstelių turėtų išreikšti teigiamus žymenis, o mažiau kaip 2 % - kraujodaros žymenis. Paviršiaus žymenų profiliai gali skirtis priklausomai nuo donoro amžiaus, danties tipo (pieninis ar nuolatinis) ir išėjimo iš danties skaičiaus, todėl svarbu taikyti standartizuotus apibūdinimo protokolus.

Kolonijas formuojančių vienetų testais kiekybiškai įvertinamas kamieninių ląstelių dažnis DPSC preparatuose. Pavienės ląstelės, paskleistos kloniniu tankiu, pasižymi skirtingu gebėjimu formuoti kolonijas, o tai rodo pirminių izoliatų heterogeniškumą. Kolonijų formavimo efektyvumas paprastai svyruoja nuo 20 iki 80 %, priklausomai nuo išskyrimo metodo ir auginimo sąlygų, o mažėjantis efektyvumas, esant didesniam pasatų skaičiui, rodo kamieninių ląstelių išsekimą.

Daugialinijinės diferenciacijos protokolai

Osteogeninei diferenciacijai naudojama standartinė indukcinė terpė, kurios pagrindinėje terpėje yra deksametazono (10 nM), β-glicerofosfato (10 mM) ir askorbo rūgšties (50 μg/ml). Po 14-21 indukcijos dienos mineralizuoto matrikso nusėdimas nustatomas dažant Alizarino raudonuoju arba von Kossa dažais, o osteogeninių genų (RUNX2, osteokalcino, osteopontino) raiška patvirtina diferenciaciją. DPSC osteogeninis pajėgumas yra pagrindas taikyti kaulinio audinio inžinerijoje ir dantų regeneracijoje.

Adipogeninei diferenciacijai naudojama terpė, kurioje yra deksametazono (1 μM), insulino (10 μg/ml), indometacino (200 μM) ir 3-izobutil-1-metilksantino (0,5 mM). Lipidų lašelių kaupimasis po 14-21 dienos vizualizuotas dažant raudonuoju aliejumi O. DPSC adipogeninis pajėgumas paprastai būna mažesnis nei kaulų čiulpų MSC, o tai atspindi jų nervų keteros vystymosi kilmę.

Neurogeninė diferenciacija išskiria DPSC iš kitų MSC šaltinių dėl jų nervų keteros kilmės. Indukcijos protokolai, kuriuose naudojami neurotrofiniai veiksniai (BDNF, NGF, NT-3) ir retinoinė rūgštis, skatina į neuronus panašią morfologiją ir neuronų žymenų (β-III tubulino, NeuN, MAP2) raišką. Šis neurogeninis potencialas padeda taikyti neurodegeneracinių ligų gydymui ir nervų regeneracijai.

Palyginimas su kitais mezenchiminių kamieninių ląstelių šaltiniais

DPSC turi keletą privalumų, palyginti su kaulų čiulpų MSC, įskaitant neinvazinį surinkimą, didesnį proliferacijos greitį ir didesnį neurogeninį potencialą. Tačiau kaulų čiulpų MSC vis dar yra geriau apibūdintos daugeliui terapinių taikymų ir turi daugiau klinikinio saugumo duomenų. Tiesioginis DPSC ir BM-MSC efektyvumo palyginimas įvairiose srityse padeda pasirinkti šaltinį konkretiems terapiniams tikslams pasiekti.

Žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės - kaulų čiulpai (HMSC-BM) yra aukso standarto MSC šaltinis lyginamiesiems tyrimams. Žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės - riebalinis audinys yra dar vienas prieinamas šaltinis, pasižymintis išskirtinėmis savybėmis. Žmogaus mezenchiminės kamieninės ląstelės - Whartono želė iš bambos virkštelės yra jaunesnis MSC šaltinis, galintis pasižymėti didesniu stiprumu.

Kamieninės ląstelės iš žmogaus eksfoliacinių pieninių dantų (SHED) yra gimininga dantų kamieninių ląstelių populiacija, pasižyminti didesniais proliferacijos rodikliais nei iš nuolatinių dantų gauti DPSC. Natūralus pieninių dantų eksfoliacija suteikia neinvazinę galimybę surinkti pediatrines kamienines ląsteles. SHED pasižymi geresne osteogenine ir odontogenine diferenciacija, palyginti su suaugusiųjų DPSC.

Terapinis pritaikymas

Dantų regeneracija - tai tiesioginis DPSC pritaikymas, kai panaudojamas jų odontogeninis diferenciacijos gebėjimas. Ikiklinikiniai tyrimai rodo, kad DPSC tarpininkauja dentino formavimuisi, pulpos audinio regeneracijai ir viso danties struktūros vystymuisi. Klinikiniai tyrimai, kuriuose vertinamas autologinis DPSC implantavimas pulpos regeneracijai, rodo daug žadančius rezultatus brandžių nuolatinių dantų su nekrozine pulpa.

Kaulų audinių inžinerijos srityje DPSC osteogeninės savybės panaudojamos kraniofacialinėms ir ortopedinėms indikacijoms. DPSC, pasėti ant biosuderinamų pastolių, in vivo sukuria mineralizuotą kaulinį audinį. Kaukolės nervų kekės kilmės DPSC gali turėti pranašumų kaukolės ir veido kaulų regeneracijai, palyginti su mezodermos kilmės MSC.

Neurologijoje galima pasinaudoti DPSC neurogeniniu potencialu ir neurotrofinių veiksnių sekrecija. Ikiklinikiniai tyrimai rodo, kad DPSC tarpininkauja gerinant insulto, nugaros smegenų pažeidimo ir periferinių nervų pažeidimo modelius. Mechanizmas apima ir ląstelių pakeitimą, ir parakrininį poveikį, pasireiškiantį nervų augimo faktoriaus, smegenų kilmės neurotrofinio faktoriaus ir kitų neurotrofinų sekrecija.

Kokybės užtikrinimas ir bankininkystė

Ilgalaikiam DPSC bankininkystei reikalingi standartizuoti protokolai, užtikrinantys ląstelių gyvybingumą ir funkciją po atšildymo. Kontroliuojamo greičio šaldymas su DMSO turinčia kriokonservavimo terpe apsaugo ląsteles šaldymo ir laikymo metu. Sėkmingą kriokonservavimą patvirtina didesnis nei 80 % gyvybingumas po atšildymo ir išlaikoma paviršiaus žymenų raiška.

Ląstelių linijos autentiškumo nustatymas pagal STR profilį leidžia nustatyti donoro tapatybę ir atskirti DPSC preparatus, gautus iš skirtingų asmenų. Mikoplazmos tyrimas užtikrina kultūros vientisumą per visas plėtimosi ir bankininkystės procedūras. Šios kokybės kontrolės priemonės yra būtinos klinikinės kokybės DPSC paruošimui.

Išėjimo skaičiaus dokumentavimas leidžia stebėti bendrą populiacijos padvigubėjimą ir palyginti eksperimentus. DPSC išlaiko kamieninių ląstelių savybes maždaug 3-7 stadijų metu, o senėjimo žymenys išryškėja vėlesnėse stadijose. Ankstyvųjų stadijų atsargų saugojimas išsaugo terapinį potencialą, kad būtų galima naudoti ateityje.

Išvada

Dantų pulpos kamieninės ląstelės yra lengvai prieinamas, multipotentinis kamieninių ląstelių šaltinis, turintis didelį terapinį potencialą. Standartizuoti išskyrimo, auginimo ir apibūdinimo protokolai užtikrina pastovią ląstelių kokybę atliekant mokslinius tyrimus ir klinikinį taikymą. Unikali DPSC nervų keteros kilmė suteikia diferenciacijos galimybes, kurios skiriasi nuo kitų MSC šaltinių, ypač link neurogeninių linijų. Tęsiant klinikinę plėtrą, DPSC taps vertingomis priemonėmis regeneracinėje medicinoje, apimančioje dantų, skeleto ir neurologines indikacijas.