Dental Pulp Stem Cells: Isolation, Culture, and Therapeutic Applications

เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟัน: การแยก, การเพาะเลี้ยง, และการประยุกต์ใช้ทางการรักษา

เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟัน (DPSCs) เป็นแหล่งที่สามารถเข้าถึงได้ง่ายของเซลล์ต้นกำเนิดเมเซนไคม์ที่มีศักยภาพในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์หลายชนิด และมีศักยภาพทางการแพทย์ฟื้นฟูที่สำคัญเซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อโพรงประสาทฟัน (DPSCs) สามารถแยกได้จากเนื้อเยื่ออ่อนภายในฟันโดยไม่ทำลายฟัน โดยสามารถเก็บได้จากฟันที่ถอนออกแล้ว รวมถึงฟันกรามซี่สุดท้ายที่มักถอนออกในระหว่างการรักษาทางทันตกรรม เซลล์เหล่านี้มีความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์หลายชนิด เช่น เซลล์สร้างเนื้อฟัน (odontoblasts) เซลล์สร้างกระดูก (osteoblasts) เซลล์ไขมัน (adipocytes) เซลล์สร้างกระดูกอ่อน (chondrocytes) และเซลล์คล้ายเซลล์ประสาท ทำให้เซลล์เหล่านี้เป็นทางเลือกที่น่าสนใจสำหรับการนำไปใช้ในทางการแพทย์หลากหลายด้าน ตั้งแต่การฟื้นฟูเนื้อเยื่อฟันไปจนถึงการซ่อมแซมระบบประสาท

ประเด็นสำคัญ

• เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟันมนุษย์ (DPSCs) สามารถแยกได้จากฟันที่ถอนออกแล้วโดยวิธีการย่อยด้วยเอนไซม์หรือวิธีการเพาะเลี้ยงแบบปลูกถ่าย
• เซลล์เหล่านี้แสดงตัวบ่งชี้ของเซลล์ต้นกำเนิดเมเซนไคม์ (CD73, CD90, CD105) ในขณะที่ไม่มีตัวบ่งชี้ของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด
• เซลล์ต้นกำเนิดจากเยื่อบุผิวของมนุษย์ (DPSCs) แสดงความสามารถในการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ชนิดต่าง ๆ ได้หลายชนิด (multipotent differentiation capacity) ไปยังเส้นทางของเซลล์สร้างกระดูก (osteogenic), เซลล์ไขมัน (adipogenic), เซลล์สร้าง
• สภาวะวัฒนธรรมที่เหมาะสมที่สุดคือการสร้างสมดุลระหว่างความสามารถในการเพิ่มจำนวนกับการรักษาคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิด
• การประยุกต์ใช้ในทางการแพทย์ครอบคลุมถึงการฟื้นฟูลักษณะฟัน การซ่อมแซมกระดูก และการรักษาโรคทางระบบประสาท

วิธีการแยกสกัดเซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อฟัน

มีวิธีการหลักสองวิธีในการแยก DPSC: การย่อยด้วยเอนไซม์และการเพาะเลี้ยงแบบปลูกถ่าย (การเจริญเติบโตภายนอก) การย่อยด้วยเอนไซม์ใช้คอลลาจีเนสชนิดที่ I และดิสเปสในการแยกเนื้อเยื่อเยื่อกระดาษให้เป็นสารแขวนลอยเซลล์เดี่ยว ซึ่งให้จำนวนเซลล์เริ่มต้นที่สูงกว่าแต่มีผลกระทบต่อตัวบ่งชี้บนพื้นผิวเซลล์ได้ การเพาะเลี้ยงแบบปลูกถ่ายเกี่ยวข้องกับการสับเนื้อเยื่อเยื่อกระดาษและปล่อยให้เซลล์เคลื่อนที่จากเศษเนื้อเยื่อ ซึ่งผลิตเซลล์ที่มีคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดที่คงอยู่ได้ดีกว่าแต่ให้ผลผลิตเริ่มต้นที่ต่ำกว่า

โปรโตคอลการย่อยด้วยเอนไซม์เริ่มต้นด้วยการสกัดเนื้อเยื่อเนื้อฟันออกจากส่วนของฟันและรากฟันทางกลไก หลังจากล้างด้วยสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มียาปฏิชีวนะ เนื้อเยื่อฟันจะถูกสับละเอียดและบ่มในสารละลายคอลลาจีเนสชนิดที่ I (3 มก./มล.) และดิสเปส (4 มก./มล.) เป็นเวลา 1-2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C สารแขวนลอยเซลล์ที่ได้จะถูกกรองผ่านตะแกรงขนาด 70 ไมโครเมตร ปั่นเหวี่ยง และเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม

เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟันมนุษย์ (hDPSC)มีจำหน่ายในรูปแบบที่ผ่านการคัดแยกและเก็บรักษาด้วยความเย็น พร้อมสำหรับการนำไปใช้ในงานวิจัย สำหรับนักวิจัยที่สนใจประชากรเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันประเภทอื่นเซลล์ต้นกำเนิดจากรูฟันมนุษย์ (hDFSC)เป็นแหล่งทางเลือกที่มีคุณสมบัติการเปลี่ยนสภาพเฉพาะตัว เซลล์เหล่านี้มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์และให้วัสดุเริ่มต้นที่มีมาตรฐาน พร้อมข้อมูลคุณภาพที่ผ่านการรับรอง

การปรับสภาพอาหารเลี้ยงเชื้อให้เหมาะสม

การเพาะเลี้ยงเซลล์มาตรฐานใน DPSC ใช้สื่ออาหารเลี้ยงเซลล์แบบ Eagle's medium ที่ดัดแปลงด้วยแอลฟา (α-MEM) หรือ Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) ที่เสริมด้วยเซรั่มจากเลือดวัวตัวเมียที่ตั้งท้อง 10-20% และยาปฏิชีวนะ การเสริมสื่ออาหารด้วย basic fibroblast growth factor (bFGF, 5-10 ng/mL) ช่วยเพิ่มการเพิ่มจำนวนเซลล์ในขณะที่อาจส่งผลต่อความสามารถในการเปลี่ยนแปลงรูปแบบ การเลือกสื่ออาหารขึ้นอยู่กับความสมดุลระหว่างการขยายตัวอย่างรวดเร็วและการคงไว้ซึ่งคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิด

ระบบเพาะเลี้ยงปราศจากซีรั่มช่วยลดความแปรปรวนระหว่างชุดเพาะเลี้ยงและการสัมผัสกับส่วนประกอบจากสิ่งมีชีวิตต่างสายพันธุ์สำหรับการใช้งานทางคลินิก สื่อเพาะเลี้ยงปราศจากซีรั่มที่มีองค์ประกอบชัดเจนซึ่งประกอบด้วยปัจจัยการเจริญเติบโตเฉพาะ อินซูลิน ทรานส์เฟอริน และซีลีเนียม สามารถรักษาศักยภาพในการเพิ่มจำนวนและการเปลี่ยนแปลงลักษณะของเซลล์ต้นกำเนิดจากผิวหนังมนุษย์ (DPSC) การเปลี่ยนผ่านจากสภาวะที่มีซีรั่มไปสู่ปราศจากซีรั่มจำเป็นต้องค่อยเป็นค่อยไปเพื่อป้องกันการเกิดความเครียดในเซลล์

DMEMให้พื้นฐานมาตรฐานสำหรับวัฒนธรรม DPSC. การผสมDMEM กับ Ham's F12ให้สัดส่วนสารอาหารที่ปรับเปลี่ยนแล้วซึ่งนักวิจัยบางท่านอาจต้องการ.Freeze Medium CM-1ช่วยให้สามารถเก็บรักษา DPSC ที่ได้รับการจำแนกไว้ในสภาพแช่แข็งได้.Freeze Medium CM-ACF ที่ไม่มีเซรั่มช่วยสนับสนุนโปรโตคอลการเก็บรักษาในระดับคลินิก.

การจำแนกและควบคุมคุณภาพ

เกณฑ์ของสมาคมระหว่างประเทศเพื่อการบำบัดด้วยเซลล์ (ISCT) กำหนดมาตรฐานขั้นต่ำสำหรับการจำแนกลักษณะของเซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์DPSC ต้องแสดงให้เห็นการยึดเกาะกับพลาสติกภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงมาตรฐาน การแสดงออกของตัวบ่งชี้พื้นผิวเฉพาะ (CD73, CD90, CD105 เป็นบวก; CD34, CD45, HLA-DR เป็นลบ) และความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์สามสายพันธุ์ ได้แก่ ออสทีโอบลาสต์ ไขมัน และคอนโดรไซต์ เกณฑ์เหล่านี้กำหนดเอกลักษณ์ของ DPSC และแยกแยะออกจากประชากรเซลล์อื่นๆ

การวิเคราะห์ด้วยโฟลไซโตเมทรีให้การประเมินเชิงปริมาณของการแสดงออกของเครื่องหมายบนพื้นผิวในประชากรเซลล์ DPSC มากกว่า 95% ของเซลล์ควรแสดงเครื่องหมายบวก ในขณะที่น้อยกว่า 2% แสดงเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด โปรไฟล์ของเครื่องหมายบนพื้นผิวอาจแตกต่างกันไปตามอายุของผู้บริจาค ประเภทของฟัน (ฟันน้ำนมเทียบกับฟันแท้) และจำนวนครั้งที่ผ่านกระบวนการเพาะเลี้ยง ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของการใช้โปรโตคอลการจำแนกคุณลักษณะที่เป็นมาตรฐาน

การทดสอบจำนวนหน่วยสร้างโคโลนี (Colony-forming unit assays) วัดความถี่ของเซลล์ต้นกำเนิดในตัวอย่าง DPSC โดยเซลล์เดี่ยวที่เพาะเลี้ยงในความหนาแน่นแบบโคลนจะแสดงความสามารถในการสร้างโคโลนีที่แตกต่างกัน ซึ่งสะท้อนถึงความหลากหลายภายในตัวอย่างที่แยกได้ครั้งแรก ประสิทธิภาพการสร้างโคโลนีโดยทั่วไปอยู่ระหว่าง 20-80% ขึ้นอยู่กับวิธีการแยกและสภาวะการเพาะเลี้ยง โดยประสิทธิภาพจะลดลงเมื่อจำนวนครั้งที่ผ่านเพิ่มมากขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงการลดลงของเซลล์ต้นกำเนิด

โปรโตคอลการแยกสายพันธุ์หลายสาย

การแยกตัวเป็นเซลล์สร้างกระดูกใช้สื่อการเหนี่ยวนำมาตรฐานที่มีเดกซาเมทาโซน (10 นาโนโมลาร์), β-กลีเซอโรฟอสเฟต (10 มิลลิโมลาร์) และกรดแอสคอร์บิก (50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ในสื่อพื้นฐานหลังจาก 14-21 วันของการเหนี่ยวนำ จะตรวจพบการสะสมของเมทริกซ์ที่มีแร่ธาตุโดยการย้อมสีด้วย Alizarin Red หรือ von Kossa และการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการสร้างกระดูก (RUNX2, osteocalcin, osteopontin) ยืนยันการแยกตัวได้ของเซลล์ DPSC ความสามารถในการสร้างกระดูกของ DPSC เป็นพื้นฐานสำหรับการประยุกต์ใช้ในวิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูกและการฟื้นฟูลักษณะทางทันตกรรม

การแยกตัวเป็นเซลล์ไขมันใช้สื่อที่มี dexamethasone (1 μM), insulin (10 μg/mL), indomethacin (200 μM), และ 3-isobutyl-1-methylxanthine (0.5 mM) การสะสมของหยดไขมันจะถูกสังเกตเห็นโดยการย้อมด้วย Oil Red O หลังจาก 14-21 วันความสามารถในการสร้างไขมันของเซลล์ต้นกำเนิดจากไขมัน (DPSC) มักจะต่ำกว่าเซลล์ต้นกำเนิดจากไขกระดูก (MSCs) ซึ่งสะท้อนถึงแหล่งกำเนิดจากพัฒนาการของยอดประสาทของพวกมัน

การแยกแยะทางประสาทวิทยา (Neurogenic differentiation) ทำให้ DPSCs แตกต่างจากแหล่ง MSC อื่น ๆ เนื่องจากมีต้นกำเนิดจาก neural crest โปรโตคอลการเหนี่ยวนำโดยใช้ปัจจัย neurotrophic (BDNF, NGF, NT-3) และกรด retinoic ส่งเสริมลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่คล้ายกับระบบประสาทและการแสดงออกของเครื่องหมายของเซลล์ประสาท (β-III tubulin, NeuN, MAP2) ศักยภาพทางประสาทวิทยาดังกล่าวสนับสนุนการประยุกต์ใช้ในด้านการรักษาโรคทางระบบประสาทเสื่อมและการฟื้นฟูเส้นประสาท

การเปรียบเทียบกับแหล่งที่มาของเซลล์ต้นกำเนิดเมเซนไคม์อื่น ๆ

DPSC มีข้อได้เปรียบหลายประการเหนือ MSC ที่ได้จากไขกระดูก รวมถึงการเก็บตัวอย่างที่ไม่รุกราน อัตราการเพิ่มจำนวนที่สูงกว่า และศักยภาพในการสร้างเซลล์ประสาทที่ดีกว่า อย่างไรก็ตาม MSC จากไขกระดูกยังคงได้รับการศึกษาลักษณะเฉพาะมากกว่าสำหรับการประยุกต์ใช้ทางบำบัดหลายประเภท และมีข้อมูลความปลอดภัยทางคลินิกที่ครอบคลุมมากกว่า การเปรียบเทียบประสิทธิภาพของ DPSC และ BM-MSC โดยตรงในหลากหลายการประยุกต์ใช้ จะช่วยในการเลือกแหล่งที่มาที่เหมาะสมสำหรับเป้าหมายการรักษาเฉพาะ

เซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์จากมนุษย์ - ไขกระดูก (HMSC-BM)เป็นแหล่งเซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์มาตรฐานทองคำสำหรับการศึกษาเปรียบเทียบเซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์จากมนุษย์ - เนื้อเยื่อไขมันเป็นแหล่งที่สามารถเข้าถึงได้อีกแหล่งหนึ่งซึ่งมีคุณสมบัติที่แตกต่างเซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์จากมนุษย์ - วาร์ตันเจลลี่จากสายสะดือเป็นแหล่งเซลล์ต้นกำเนิดชนิดมีเซนไคม์ที่อายุน้อยกว่าซึ่งอาจมีศักยภาพที่เพิ่มขึ้น

เซลล์ต้นกำเนิดจากฟันน้ำนมที่หลุดเองของมนุษย์ (SHED) เป็นประชากรเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันที่เกี่ยวข้องซึ่งมีอัตราการเพิ่มจำนวนสูงกว่าเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันถาวร (DPSCs) การหลุดออกตามธรรมชาติของฟันน้ำนมเป็นโอกาสที่ไม่รุกรานในการเก็บรวบรวมเซลล์ต้นกำเนิดจากเด็กเพื่อการธนาคาร เซลล์ต้นกำเนิดจากฟันน้ำนมที่หลุดเองแสดงให้เห็นถึงการแตกต่างไปเป็นเซลล์สร้างกระดูกและเซลล์สร้างฟันที่ดีกว่าเมื่อเทียบกับเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันผู้ใหญ่ (DPSCs)

การประยุกต์ใช้ในทางบำบัด

การฟื้นฟูลักษณะฟันถือเป็นรูปแบบการประยุกต์ใช้เซลล์ต้นกำเนิดจากฟันน้ำนมโดยตรงที่สุด โดยอาศัยความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์สร้างฟันของพวกมัน การศึกษาในสัตว์ทดลองแสดงให้เห็นการก่อตัวของเนื้อฟัน การฟื้นฟูเนื้อเยื่อโพรงประสาทฟัน และการพัฒนาโครงสร้างฟันทั้งหมดที่เกิดจากเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันน้ำนม การทดลองทางคลินิกที่ประเมินการปลูกถ่ายเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันน้ำนมของผู้ป่วยเองเพื่อฟื้นฟูโพรงประสาทฟันแสดงผลลัพธ์ที่น่าพอใจในฟันแท้ที่โตเต็มที่ซึ่งมีโพรงประสาทฟันตาย

การประยุกต์ใช้วิศวกรรมเนื้อเยื่อกระดูกใช้ศักยภาพในการสร้างกระดูกของเซลล์ต้นกำเนิดจากฟันน้ำนม (DPSC) สำหรับการรักษาภาวะผิดปกติของกะโหลกศีรษะและกระดูก การปลูกถ่ายเซลล์ DPSC บนโครงร่างที่เข้ากันได้ทางชีวภาพสามารถสร้างเนื้อเยื่อกระดูกที่มีแร่ธาตุในร่างกายได้ ต้นกำเนิดจากยอดประสาทของกะโหลกศีรษะของ DPSC อาจให้ข้อได้เปรียบในการสร้างกระดูกของกะโหลกศีรษะเมื่อเทียบกับเซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อกลาง (MSCs) ที่ได้มาจากเนื้อเยื่อกลาง

การประยุกต์ใช้ทางระบบประสาทใช้ประโยชน์จากศักยภาพในการสร้างเซลล์ประสาทและการหลั่งปัจจัยบำรุงประสาทของเซลล์ต้นกำเนิดจากไขมันชนิด DPSC การศึกษาในสัตว์ทดลองก่อนคลินิกแสดงให้เห็นการปรับปรุงที่เกิดจาก DPSC ในแบบจำลองโรคหลอดเลือดสมอง การบาดเจ็บไขสันหลัง และความเสียหายของเส้นประสาทส่วนปลาย กลไกเกี่ยวข้องกับการทดแทนเซลล์และผลพาราไครน์ผ่านการหลั่งปัจจัยการเจริญเติบโตของเส้นประสาท ปัจจัยบำรุงประสาทที่มาจากสมอง และนิวโรโทรฟินอื่นๆ

การประกันคุณภาพและการธนาคาร

การเก็บรักษาเซลล์ต้นกำเนิดในธนาคารระยะยาวต้องใช้โปรโตคอลมาตรฐานที่รับประกันความมีชีวิตและการทำงานของเซลล์เมื่อละลายน้ำแข็ง การแช่แข็งแบบควบคุมอัตราการแช่แข็งด้วยสารละลายแช่แข็งที่มี DMSO ช่วยปกป้องเซลล์ระหว่างการแช่แข็งและการเก็บรักษา ความมีชีวิตหลังการละลายน้ำแข็งที่เกิน 80% และการคงอยู่ของตัวบ่งชี้บนผิวเซลล์ยืนยันความสำเร็จของการแช่แข็ง

การตรวจสอบสายพันธุ์เซลล์ผ่านการวิเคราะห์STR ช่วยยืนยันตัวตนของผู้บริจาคและแยกความแตกต่างระหว่างตัวอย่าง DPSC ที่มาจากบุคคลต่าง ๆการทดสอบการปนเปื้อนของไมโคพลาสมาช่วยรับประกันความสมบูรณ์ของวัฒนธรรมเซลล์ตลอดกระบวนการขยายและเก็บรักษา มาตรการควบคุมคุณภาพเหล่านี้มีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการเตรียม DPSC ที่มีคุณภาพระดับคลินิก

เอกสารหมายเลขการผ่านติดตามการเพิ่มจำนวนประชากรแบบทวีคูณสะสมและช่วยให้สามารถเปรียบเทียบระหว่างการทดลองต่างๆ ได้ DPSC ยังคงรักษาคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดไว้ได้จนถึงประมาณการผ่านครั้งที่ 3-7 โดยมีเครื่องหมายบ่งชี้การแก่ชราปรากฏขึ้นที่การผ่านที่สูงขึ้น การเก็บรักษาสต็อกในระยะแรกช่วยรักษาศักยภาพในการรักษาสำหรับการใช้งานในอนาคต

สรุป

เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟันน้ำนม (Dental pulp stem cells) เป็นแหล่งเซลล์ต้นกำเนิดที่สามารถเข้าถึงได้ง่ายและมีความหลากหลายในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่าง ๆ (multipotent) พร้อมศักยภาพทางการรักษาที่สำคัญ การแยกเซลล์ การเพาะเลี้ยง และการวิเคราะห์คุณสมบัติของเซลล์ตามมาตรฐานที่แน่นอนช่วยให้ได้เซลล์ที่มีคุณภาพสม่ำเสมอทั้งในงานวิจัยและการนำไปใช้ทางคลินิก ต้นกำเนิดของเซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟันน้ำนม (DPSCs) ที่มาจากเนื้อเยื่อครีสต์ประสาท (neural crest) ทำให้เซลล์เหล่านี้มีความสามารถในการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่าง ๆ ที่แตกต่างจากแหล่งเซลล์ต้นกำเนิดชนิดอื่น ๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเส้นทางการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับระบบประสาท (neurogenic lineages) การพัฒนาทางคลินิกอย่างต่อเนื่องจะช่วยให้เซลล์ต้นกำเนิดจากเนื้อเยื่อฟันน้ำนมกลายเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าในด้านการแพทย์ฟื้นฟูที่สามารถนำไปใช้ในด้านการรักษาทางทันตกรรม กระดูก และระบบประสาท