Dental Pulp Stem Cells: Isolation, Culture, and Therapeutic Applications

الخلايا الجذعية لباب الأسنان: العزل والزراعة والتطبيقات العلاجية

تمثل الخلايا الجذعية اللبية السنية اللبية (DPSCs) مصدراً يسهل الوصول إليه للخلايا الجذعية الوسيطة متعددة القدرات ذات الإمكانات الكبيرة في الطب التجديدي. يمكن الحصول على الخلايا الجذعية اللبية اللبية السنية الجذعية (DPSCs) المعزولة من الأنسجة الرخوة داخل الأسنان دون تدخل جراحي من الأسنان المخلوعة، بما في ذلك ضروس العقل التي يتم خلعها بشكل روتيني أثناء إجراءات طب الأسنان. تُظهر هذه الخلايا القدرة على التمايز إلى سلالات متعددة بما في ذلك الأرومات السنية والخلايا البانية للعظم والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية والخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية، مما يجعلها مرشحة جذابة للتطبيقات العلاجية المتنوعة من تجديد الأسنان إلى إصلاح الأعصاب.

النتائج الرئيسية

• يمكن عزل خلايا DPSCs من الأسنان المستخرجة من خلال الهضم الأنزيمي أو طرق الاستنبات الاستكشافية
• تُعبّر هذه الخلايا عن علامات الخلايا الجذعية الوسيطة (CD73، CD90، CD105) بينما تفتقر إلى علامات الخلايا الجذعية المكونة للدم
• تُظهر خلايا DPSCs قدرة تمايز متعددة القدرات نحو السلالات العظمية والشحمية والغضروفية والعصبية المنشأ
• ظروف الاستزراع المثلى توازن بين القدرة على الانتشار والحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية
• تشمل التطبيقات العلاجية تجديد الأسنان، وإصلاح العظام، وعلاج الأمراض العصبية

طرق عزل الخلايا الجذعية للُب الأسنان

توجد طريقتان أساسيتان لعزل الخلايا الجذعية اللبية السنية DPSC: الهضم الأنزيمي وزراعة النبتة (النامية). يستخدم الهضم الأنزيمي استخدام الكولاجيناز من النوع الأول والتخلص من الأنزيمات لتفكيك أنسجة اللب إلى معلقات أحادية الخلية، مما ينتج عنه أعداد خلايا أولية أعلى ولكن من المحتمل أن يؤثر على علامات سطح الخلية. تنطوي زراعة المستنبت على فرم أنسجة اللب والسماح للخلايا بالهجرة من أجزاء الأنسجة، مما ينتج خلايا ذات خصائص خلايا جذعية محفوظة بشكل أفضل ولكن بإنتاجية أولية أقل.

يبدأ بروتوكول الهضم الأنزيمي باستخراج ميكانيكي لأنسجة اللب من تاج السن وجذره. وبعد الغسل في محلول ملحي مخفوق بالفوسفات مع المضادات الحيوية، يتم فرم اللب وتحضينه في محلول كولاجيناز من النوع الأول (3 ملغم/مل) ومحلول ديسباسيز (4 ملغم/مل) لمدة ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتم ترشيح المعلق الخلوي الناتج من خلال مصفاة بحجم 70 ميكرومتر، ويتم طرده مركزيًا، ثم يُطحن في وسط الاستزراع المناسب.

تتوافرالخلايا الجذعية لب الأسنان البشرية (hDPSC) كمستحضرات محفوظة بالتبريد ومميزة وجاهزة للتطبيقات البحثية. بالنسبة للباحثين الذين يبحثون عن مجموعات الخلايا الجذعية السنية ذات الصلة، توفر الخلايا الجذعية لجُريب الأسنان البشري (hDFSC) مصدراً بديلاً بخصائص تمايز متميزة. توفر هذه الخلايا المتوفرة تجارياً مواد أولية موحدة بمقاييس جودة موثقة.

تحسين وسط الاستزراع

تستخدم المزرعة القياسية لخلايا DPSC وسط النسر المعدل ألفا (α-MEM) أو وسط النسر المعدل دولبيكو (DMEM) المضاف إليه 10-20% من مصل الأبقار الجنيني والمضادات الحيوية. تعمل مكملات الوسط بعامل نمو الأرومة الليفية الأساسية (bFGF، 5-10 نانوغرام/ملل) على تعزيز التكاثر مع احتمال التأثير على القدرة على التمايز. إن التوازن بين التمدد السريع والحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية يوجه اختيار الوسط.

تقلل أنظمة الاستزراع الخالية من المصل من التباين من دفعة إلى أخرى والتعرض للمكونات المولدة للأجسام الغريبة للتطبيقات السريرية. تحافظ الوسائط المحددة الخالية من المصل التي تحتوي على عوامل نمو محددة والأنسولين والترانسفيرين والسيلينيوم على تكاثر الخلايا الجذعية الخالية من المصل وإمكانات التمايز. ويتطلب الانتقال من الظروف المحتوية على المصل إلى الظروف الخالية من المصل التكيف التدريجي لمنع إجهاد الخلايا.

يوفرDMEM وسطًا أساسيًا قياسيًا لزراعة خلايا DPSC. توفر توليفات DMEM/Ham's F12 نسب مغذيات معدلة يفضلها بعض الباحثين. ويتيح وسيط التجميد CM-1 حفظ مخزون الخلايا الجذعية DPSC بالتبريد، بينما يدعم وسيط التجميد الخالي من المصل CM-ACF بروتوكولات بنوك الدرجة السريرية.

التوصيف ومراقبة الجودة

تحدد معايير الجمعية الدولية للعلاج بالخلايا (ISCT) معايير الحد الأدنى لتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة. يجب أن تُظهر الخلايا الجذعية الوسيطة الوسيطة الوسيطة الالتزام البلاستيكي في ظل ظروف الاستزراع القياسية، والتعبير عن علامات سطحية محددة (CD73، CD90، CD105 إيجابية؛ CD34، CD45، HLA-DR سلبية)، والقدرة على التمايز ثلاثي الأشكال نحو الخلايا العظمية البانية للعظام والخلايا الشحمية والخلايا الغضروفية. تحدد هذه المعايير هوية الخلايا الخلوية الصلبة النخاعية الشوكية DPSC وتميزها عن مجموعات الخلايا الأخرى.

يوفر قياس التدفق الخلوي تقييماً كمياً للتعبير عن العلامات السطحية عبر مجموعات خلايا الخلايا الجذعية النخاعية البقعية. يجب أن تعبر أكثر من 95% من الخلايا عن علامات إيجابية، بينما يعبر أقل من 2% من الخلايا عن علامات المكونة للدم. قد تختلف سمات الواسمات السطحية باختلاف عمر المتبرع ونوع الأسنان (الأسنان المتساقطة مقابل الأسنان الدائمة) وعدد مرات مرورها، مما يؤكد أهمية بروتوكولات التوصيف الموحدة.

تقيس مقايسات وحدة تشكيل المستعمرة تواتر الخلايا الجذعية داخل مستحضرات DPSC. تُظهر الخلايا المفردة الموضوعة بكثافة استنساخية قدرة متفاوتة على تكوين المستعمرات، مما يعكس عدم التجانس داخل العزلات الأولية. وتتراوح كفاءة تكوين المستعمرات عادةً بين 20-80% اعتماداً على طريقة العزل وظروف الاستزراع، مع انخفاض الكفاءة عند أعداد مرور أعلى مما يشير إلى نضوب الخلايا الجذعية.

بروتوكولات التمايز متعدد الأطوار

يستخدم التمايز العظمي المنشأ وسط تحريضي قياسي يحتوي على ديكساميثازون (10 نانومتر)، وبيتا، وغليسيروفوسفات (10 مللي مولار)، وحمض الأسكوربيك (50 ميكروغرام/مللتر) في وسط أساسي. بعد 14-21 يومًا من التحريض، يتم الكشف عن ترسب المصفوفة المعدنية عن طريق تلوين أليزارين الأحمر أو فون كوسا، ويؤكد التعبير الجيني المولد للعظام (RUNX2، أوستيوكالسين، أوستيوبونتين) التمايز. تكمن قدرة DPSC على توليد العظام في التطبيقات في هندسة الأنسجة العظمية وتجديد الأسنان.

يستخدم التمايز الشحمي وسطًا يحتوي على ديكساميثازون (1 ميكرومتر)، والأنسولين (10 ميكروغرام/مل)، والإندوميثاسين (200 ميكرومتر)، و3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين (0.5 مللي متر). يتم تصوير تراكم القطرات الدهنية بعد 14-21 يوماً بواسطة تلوين الزيت الأحمر O. عادةً ما تكون قدرة الخلايا الجذعية الشحمية DPSC أقل من الخلايا الجذعية الصلبة المستمدة من نخاع العظم، مما يعكس أصلها النمائي للعقدة العصبية.

ويميز التمايز العصبي المنشأ بين الخلايا الجذعية الصلبة المتصلبة DPSCs عن مصادر الخلايا الجذعية الصلبة الأخرى بسبب أصلها من العرف العصبي. تعزز بروتوكولات التحريض باستخدام عوامل التغذية العصبية (BDNF وNGF وNT-3) وحمض الريتينويك التشكل العصبي والتعبير عن العلامات العصبية (توبولين بيتا الثالث، ونيو ن، وMAP2). تدعم هذه الإمكانية العصبية الوراثية التطبيقات في علاج الأمراض العصبية التنكسية وتجديد الأعصاب.

المقارنة مع مصادر الخلايا الجذعية الوسيطة اللُّحمية الأخرى

تقدم الخلايا الجذعية الوسيطة اللحمية الوسيطة المستمدة من النخاع العظمي العديد من المزايا مقارنةً بالخلايا الجذعية الوسيطة المستمدة من نخاع العظم، بما في ذلك التجميع غير الجراحي ومعدلات الانتشار الأعلى والإمكانات العصبية المعززة. ومع ذلك، لا تزال الخلايا الجذعية الصلبة MSCs المستمدة من نخاع العظم تتميز بخصائص أفضل للعديد من التطبيقات العلاجية مع بيانات سلامة سريرية أكثر شمولاً. وتوجه المقارنة المباشرة بين أداء الخلايا الجذعية الوسيطة الوسيطة الوسيطة الوسيطة لنخاع العظم وأداء الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم عبر التطبيقات اختيار المصدر لأهداف علاجية محددة.

توفرالخلايا الجذعية الوسيطة اللُّحمية البشرية - نخاع العظم (HMSC-BM ) المصدر القياسي الذهبي للخلايا الجذعية الوسيطةالبشرية لدراسات المقارنة. توفر الخلايا الجذعية الوسيطة اللُّحمية البشرية - الأنسجة الدهنية مصدراً آخر يمكن الوصول إليه بخصائص متميزة. الخلايا الجذعية الوسيطة اللُّحمية البشرية - هلام وارتون من الحبل السري تمثل مصدراً أصغر سناً للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مع فعالية محتملة معززة.

وتمثل الخلايا الجذعية المستخلصة من الأسنان البشرية المتساقطة الأسنان (SHED) مجموعة خلايا جذعية سنية ذات صلة ذات معدلات انتشار أعلى من الخلايا الجذعية الوسيطة المتساقطة الأسنان الدائمة. يوفر التقشير الطبيعي للأسنان اللبنية المتساقطة فرصة تجميع غير جراحية للخلايا الجذعية السنية للأطفال. تُظهر الخلايا الجذعية السنية النفضية السنية التمايز المعزز للعظام والأسنان مقارنةً بالخلايا الجذعية السنية المستمدة من الخلايا الجذعية السنية المستمدة من أسنان البالغين.

التطبيقات العلاجية

يمثل تجديد الأسنان أكثر تطبيقات الخلايا الجذعية DPSC مباشرةً، حيث تستفيد من قدرتها على التمايز السني. تُظهر الدراسات ما قبل السريرية تكوين عاج الأسنان بوساطة الخلايا الجذعية DPSC، وتجديد أنسجة لب السن، وتطوير بنية الأسنان بالكامل. تُظهر التجارب السريرية التي تقيّم زرع الخلايا الجذعية DPSC ذاتية المنشأ لتجديد لب السن نتائج واعدة في الأسنان الدائمة الناضجة ذات اللب الناخر.

تستغل تطبيقات هندسة الأنسجة العظمية قدرة الخلايا الجذعية DPSC على توليد العظام في حالات القحف والوجه والعظام. تولد الخلايا الجذعية القحفية DPSCs المزروعة على سقالات متوافقة حيوياً أنسجة عظمية ممعدنة في الجسم الحي. قد يوفر أصل العرف العصبي القحفي للخلايا الجذعية القحفية العصبية القحفية مزايا لتجديد العظام القحفية الوجهية مقارنةً بالخلايا الجذعية الصلبة المستمدة من الأديم المتوسط.

تستفيد التطبيقات العصبية من إمكانات الخلايا الجذعية القحفية DPSCs العصبية وإفراز عامل التغذية العصبية. تُظهر الدراسات ما قبل السريرية تحسناً بوساطة الخلايا الجذعية الصلبة المتجانسة بوساطة الخلايا الجذعية الصلبة DPSC في نماذج السكتة الدماغية وإصابة الحبل الشوكي وتلف الأعصاب الطرفية. وتتضمن الآلية كلاً من استبدال الخلايا والتأثيرات الباراكرينية من خلال إفراز عامل نمو الأعصاب وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ وغيرها من المغذيات العصبية.

ضمان الجودة والتخزين البنكي

يتطلب تخزين خلايا الخلايا الجذعية النخاعية الصلبة DPSC على المدى الطويل بروتوكولات موحدة لضمان صلاحية الخلايا ووظيفتها عند إذابة الجليد. يحمي التجميد ذو المعدل المتحكم به مع وسط حفظ بالتبريد يحتوي على DMSO الخلايا أثناء التجميد والتخزين. وتؤكد قابلية البقاء على قيد الحياة بعد الذوبان التي تتجاوز 80% والحفاظ على تعبير العلامات السطحية نجاح الحفظ بالتبريد.

تحددمصادقة خط الخلية من خلال تحديد سمات STR هوية المتبرع وتميز بين مستحضرات الخلايا الجذعية النخاعية المتعددة الخلايا من أفراد مختلفين. ويضمن اختبار الميكوبلازما سلامة المستنبت خلال إجراءات التوسيع والإجراءات المصرفية. تُعد تدابير مراقبة الجودة هذه ضرورية لتحضير الخلايا الجذعية من الخلايا الجذعية من الدرجة السريرية.

يتتبع توثيق عدد المرات المضاعفات التراكمية للسكان ويتيح المقارنة بين التجارب. تحافظ الخلايا الجذعية DPSCs على خصائص الخلايا الجذعية خلال الممرات من 3 إلى 7 تقريباً، مع ظهور علامات الشيخوخة في الممرات الأعلى. يحافظ الاحتفاظ بمخزون الممرات المبكرة على الإمكانات العلاجية للاستخدام المستقبلي.

الخلاصة

توفر الخلايا الجذعية لباب الأسنان مصدراً للخلايا الجذعية متعددة القدرات يمكن الوصول إليه بسهولة مع إمكانات علاجية كبيرة. تضمن بروتوكولات العزل والاستزراع والتوصيف الموحدة اتساق جودة الخلايا عبر التطبيقات البحثية والسريرية. يوفر الأصل الفريد للعقيدة العصبية للخلايا الجذعية الجذعية لطبقة الخلايا الجذعية السنية DPSCs قدرات تمايز متميزة عن مصادر الخلايا الجذعية الجذعية السنية الأخرى، خاصةً نحو السلالات العصبية الوراثية. سيؤدي التطوير السريري المستمر للخلايا الجذعية المستخلصة من الخلايا الجذعية الصلبة المتصلبة DPSCs كأدوات قيّمة في تطبيقات الطب التجديدي التي تشمل مؤشرات طب الأسنان والهيكل العظمي والعصبي.