SNU-1 Cells in Helicobacter pylori Infection Studies

Helicobacter pylori infekcija serga maždaug pusė pasaulio gyventojų ir yra stipriausias žinomas skrandžio adenokarcinomos - piktybinio naviko, kurio prognozė bloga, o gydymo galimybės ribotos - rizikos veiksnys. Bendrovėje "Cytion" pripažįstame, kad norint suprasti molekulinius mechanizmus, kuriais ši bakterija skatina kancerogenezę, reikia patikimų ląstelių modelių, kurie tiksliai atkartoja skrandžio epitelio atsaką į infekciją. SNU-1 ląstelės, gautos iš Korėjos paciento, sergančio skrandžio karcinoma, yra svarbi platforma H. pylor ir šeimininko sąveikai tirti ir terapinėms strategijoms, skirtoms užkirsti kelią su infekcija susijusiam vėžio vystymuisi, nustatyti.

Pagrindinės išvados

• SNU-1 ląstelės išlaiko skrandžio epitelio savybes, būtinas H. pylori infekcijai modeliuoti
• CagA translokaciją ir VacA toksino poveikį galima tirti skrandžio vėžio ląstelių modeliuose
• Uždegiminių signalų kaskados aktyvavimas atspindi atsaką į infekciją in vivo
• Lėtinės infekcijos sukelti epigenetiniai pokyčiai skatina kancerogeninę transformaciją
• Atliekant vaistų atranką nustatomos medžiagos, blokuojančios infekcijos sukeltus onkogeninius signalus

Skrandžio vėžio ląstelių linijų atranka H. pylori tyrimams

H. pylor ir šeimininko sąveikai tirti reikalingos ląstelių linijos, išlaikančios skrandžio epitelio savybes, įskaitant tinkamą bakterijų sukibimo receptorių raišką ir funkcinius signalinius kelius, reaguojančius į virulentiškumo veiksnius. SNU skrandžio vėžio linijos, gautos iš Korėjos pacientų, yra gerai apibūdinti infekcijos tyrimų modeliai.

H. pylori tyrimams mūsų AGS ląstelės (300408 ) yra plačiausiai naudojamas skrandžio adenokarcinomos modelis infekcijos tyrimams. Šios ląstelės veiksmingai internalizuoja CagA baltymą ir pasižymi stipriu uždegiminiu signaliniu atsaku, todėl idealiai tinka virulentiškumo veiksnių mechanizmams tirti.

AGS ląstelės išreiškia adhezijos molekules, reikalingas H. pylori prisitvirtinimui, ir turi nepažeistus NF-κB signalinius kelius, būtinus uždegimo genų indukcijai. Gerai apibūdinta jų prigimtis ir gausus literatūros šaltinių sąrašas palengvina eksperimentų planavimą ir rezultatų interpretavimą.

CagA translokacija ir onkogeniniai signalai

CagA baltymas yra išsamiausiai apibūdintas H. pylori virulentiškumo veiksnys, tiesiogiai siejantis infekciją su kancerogeneze. Padermės, turinčios cag patogeniškumo salą (cag PAI), per IV tipo sekrecijos sistemą įveda CagA į šeimininko ląsteles, kur jis patiria tirozino fosforilinimą ir perima šeimininko signalinius kelius.

Perkėlus į skrandžio epitelio ląsteles, CagA fosforilina Src šeimos kinazės ties EPIYA motyvais. Fosforilinta CagA prisijungia ir aktyvuoja SHP-2 fosfatazę, dėl to vyksta ilgalaikis ERK/MAPK signalų perdavimas, ląstelių išsklaidymas ir būdinga "kolibrio" morfologija, lengvai pastebima užkrėstose AGS ląstelių kultūrose.

CagA taip pat daro nuo fosforilinimo nepriklausomą poveikį, sutrikdydama ląstelių poliariškumą dėl sąveikos su PAR1b/MARK kinazėmis ir sandarios jungties baltymais. Šis poliariškumo sutrikdymas prisideda prie epitelio barjero disfunkcijos ir ląstelių transformacijos, susijusios su lėtine H. pylori infekcija.

Stebint CagA perkėlimą naudojant antifosfo-CagA antikūnus arba CagA-GFP sintezės konstruktus, galima kiekybiškai įvertinti bakterijų pristatymo efektyvumą. Atlikus infekuotų ląstelių lizatų Western blot tyrimą, nustatomas būdingas fosforilinto CagA juostos modelis, atspindintis EPIYA motyvo fosforilinimą.

VacA sukeltas toksiškumas ląstelėms

Vakuoliuojantis citotoksinas A (VacA) yra dar vienas svarbus H. pylori virulentiškumo veiksnys, turintis daugiafunkcinį poveikį šeimininko ląstelėms. Skirtingai nei CagA, VacA yra išskiriamas ir gali veikti tiek infekuotas, tiek pašalines ląsteles, prisidėdamas prie audinių pažeidimo ir imuninės moduliacijos.

Būdingas VacA poveikis yra didelių viduląstelinių vakuolių, susidarančių iš vėlyvųjų endosomų, susidarymas. Vakuolės lengvai vizualizuojamos naudojant fazinio kontrasto mikroskopiją arba neutralaus raudonojo dažymo metodą ir gali būti kiekybiškai įvertinamos srauto citometrijos metodu, naudojant vakuolių sekimo dažus.

VacA taip pat veikia mitochondrijas, sukeldama citochromo c išsiskyrimą ir apoptozę. Šis mitochondrijų toksiškumas gali būti įvertintas matuojant membranos potencialą (JC-1, TMRE), atliekant kaspazių aktyvavimo tyrimus ir dažant Annexin V, kad būtų nustatyta apoptozinė ląstelių mirtis.

Autofagiją skatinančios VacA savybės gali prisidėti prie bakterijų išlikimo, nes neleidžia visiškai suardyti internalizuotų bakterijų. LC3 taškų susidarymas ir p62 skilimas yra VacA sukeltos autofagijos infekuotose ląstelėse žymenys.

Uždegiminio atsako apibūdinimas

H. pylori infekcija sukelia stiprias uždegimines reakcijas skrandžio epitelio ląstelėse, kurios, jei yra lėtinės, prisideda prie kancerogenezės. IL-8 indukcija yra pagrindinis infekcijos požymis, kuris pritraukia neutrofilus ir įtvirtina audinių uždegimą.

ELISA kiekybinis IL-8 sekrecijos nustatymas kultūrų supernatantuose yra jautrus, didelio našumo uždegiminio aktyvumo rodiklis. AGS ląstelėse, užkrėstose CagA teigiamais štamais, IL-8 gamyba labai padidėja, palyginti su CagA neigiamais štamais arba neužkrėstais kontroliniais egzemplioriais.

NF-κB aktyvavimas skatina IL-8 ir kitų uždegiminių genų raišką. Branduolinę p65/RelA translokaciją galima stebėti naudojant imunofluorescenciją arba branduolio ir citoplazmos frakcionavimą, po kurio atliekama Western blotting. Reporterių konstrukcijos, kuriose yra NF-κB atsako elementų, leidžia gauti kiekybinius transkripcijos rodmenis.

H. pylori sukelta COX-2 reguliacija skatina prostaglandino E2 gamybą, didina proliferaciją ir slopina apoptozę. COX-2 inhibitoriai yra perspektyvūs eksperimentiniuose modeliuose siekiant išvengti su H. pylori susijusio skrandžio vėžio.

Ilgalaikė infekcija ir kancerogeninė transformacija

Ūmios infekcijos tyrimai atspindi tiesiogines ląstelių reakcijas, tačiau kancerogenezei reikalingas lėtinis bakterinių veiksnių poveikis. Ilgalaikiai bendrų kultūrų protokolai arba pakartotiniai infekcijos ciklai gali modeliuoti nuolatinį poveikį, kuris pasireiškia natūralios infekcijos metu.

Lėtinės H. pylori infekcijos metu kaupiasi epigenetiniai pokyčiai, įskaitant DNR metilinimo pokyčius. Bisulfito sekoskaitos arba metilinimo matricos atskleidžia laipsnišką naviko slopintojų promotorių hipermetilinimą, kuris gali išlikti net po bakterijų išnaikinimo.

Transformacijos tyrimai, įskaitant minkštojo agaro kolonijų formavimąsi ir ksenograftų navikiškumą, gali įvertinti, ar ilgalaikė infekcija suteikia navikinių savybių. Šie funkciniai rodikliai yra griežčiausias infekcijos sukeltos kancerogenezės įrodymas.

Rekomenduojami produktai H. pylori infekcijos tyrimams:

• AGS ląstelės (300408) - pagrindinis skrandžio vėžio modelis H. pylori infekcijos tyrimams
• DMEM su dideliu gliukozės kiekiu (820300a) - standartinė terpė
• Užšaldymo terpė CM-ACF (800650) - Kriokonservavimo tirpalas