SNU-1 Cells in Helicobacter pylori Infection Studies

Helicobacter pylori infektsioon mõjutab umbes poolt maailma elanikkonnast ja on tugevaim teadaolev mao adenokartsinoomi riskitegur, mis on halva prognoosi ja piiratud ravivõimalustega pahaloomuline haigus. Cytionis mõistame, et molekulaarsete mehhanismide mõistmine, mille abil see bakter soodustab kantserogeneesi, nõuab tugevaid rakumudeleid, mis jäljendavad täpselt mao epiteeli reaktsiooni nakkusele. SNU-1 rakud, mis on saadud Korea maokartsinoomiga patsiendilt, on oluline platvorm H. pylori ja peremehe vahelise koostoime uurimiseks ja ravistrateegiate kindlaksmääramiseks, et vältida infektsiooniga seotud vähi arengut.

Peamised järeldused

• SNU-1 rakud säilitavad maoepiteeli omadused, mis on olulised H. pylori infektsiooni modelleerimiseks
• CagA translokatsiooni ja VacA toksiini mõju saab uurida maovähi rakumudelites
• Põletikuliste signaalkaskaadide aktiveerimine peegeldab in vivo infektsioonivastuseid
• Kroonilise infektsiooni poolt indutseeritud epigeneetilised muutused juhivad kantserogeenset transformatsiooni
• Ravimite skriininguga tuvastatakse ained, mis blokeerivad nakkuse poolt põhjustatud onkogeenset signalisatsiooni

Maovähi rakuliini valik H. pylori uuringuteks

H. pylori ja peremeesorganismi vahelise koostoime uurimiseks on vaja rakuliine, mis säilitavad maoepiteeli omadused, sealhulgas bakterite adhesiooni jaoks sobiva retseptori ekspressiooni ja funktsionaalsed signaalirajad, mis reageerivad virulentsusfaktoritele. Korea patsientidelt saadud SNU maovähi liinid pakuvad hästi iseloomulikke mudeleid infektsiooniuuringuteks.

H. pylori uuringute jaoks on meie AGS rakud (300408 ) kõige laialdasemalt kasutatav mao adenokartsinoomi mudel infektsiooniuuringuteks. Need rakud internaliseerivad tõhusalt CagA valku ja näitavad tugevat põletikulist signaalreaktsiooni, mistõttu on nad ideaalsed virulentsusfaktori mehhanismide uurimiseks.

AGS rakud ekspresseerivad H. pylori kinnitumiseks vajalikke adhesioonimolekule ja omavad puutumatuid NF-κB signaaliradu, mis on olulised põletikulise geeni indutseerimiseks. Nende hästi iseloomustatud olemus ja ulatuslik kirjanduse tugi hõlbustavad katsete kavandamist ja tulemuste tõlgendamist.

CagA translokatsioon ja onkogeenne signaalimine

CagA valk kujutab endast kõige põhjalikumalt iseloomustatud H. pylori virulentsusfaktorit, mis seob otseselt infektsiooni kantserogeneesiga. Tüved, millel on cag patogeensuse saar (cag PAI), süstivad CagA peremeesrakku IV tüüpi sekretsioonisüsteemi kaudu, kus see läbib türosiinfosforüleerimise ja kaaperdab peremeesorganismi signaaliradu.

Translokatsioonil maoepiteelirakkudesse fosforüleerivad Src perekonna kinaasid CagA-d EPIYA motiivide juures. Fosforüülitud CagA seondub ja aktiveerib SHP-2 fosfataasi, mis põhjustab püsivat ERK/MAPK-signalisatsiooni, rakkude hajumist ja iseloomulikku "kolibri" morfoloogiat, mis on kergesti täheldatav nakatunud AGS-rakukultuurides.

CagA avaldab ka fosforüleerimisest sõltumatut mõju, häirides rakkude polaarsust PAR1b/MARK kinaaside ja tihedate ühenduste valkudega suhtlemise kaudu. Selline polaarsuse häirimine aitab kaasa epiteelibarjääri düsfunktsioonile ja rakkude transformatsioonile, mis on seotud kroonilise H. pylori infektsiooniga.

CagA translokatsiooni jälgimine, kasutades fosfo-cagA-vastaseid antikehi või CagA-GFP-fusionkonstruktsioone, võimaldab hinnata kvantitatiivselt bakteri manustamise tõhusust. Nakatunud rakkude lüsaatide Western blotting näitab iseloomulikku fosforüülitud CagA ribade mustrit, mis peegeldab EPIYA-motiivi fosforüülimist.

VacA vahendatud rakutoksilisus

Vakuoliseeriv tsütotoksiin A (VacA) on veel üks oluline H. pylori virulentsusfaktor, millel on multifunktsionaalne mõju peremeesrakkudele. Erinevalt CagA-st eritub VacA ja võib toimida nii nakatunud kui ka kõrvalolevatele rakkudele, aidates kaasa kudede kahjustamisele ja immuunsüsteemi moduleerimisele.

VacA iseloomulikuks toimeks on suurte rakusiseste vaakoolide moodustamine, mis pärinevad hilistest endosomaalsetest kompartmentidest. Vakuolatsiooni on lihtne visualiseerida faasikontrastmikroskoopia või neutraalpunase värvimise abil ning seda saab kvantifitseerida voolutsütomeetria abil, kasutades vakuoolide jälgimise värvaineid.

VacA on suunatud ka mitokondritele, indutseerides tsütokroom c vabanemist ja apoptoosi. Seda mitokondriaalset toksilisust saab hinnata membraanipotentsiaali mõõtmise (JC-1, TMRE), kaspaasi aktiveerimise analüüside ja Annexin V värvimise abil apoptootilise rakusurma tuvastamiseks.

VacA autofaagiat esilekutsuvad omadused võivad aidata kaasa bakterite püsimajäämisele, takistades internaliseeritud bakterite täielikku lagundamist. LC3-punktide moodustumine ja p62 lagunemine on markerid VacA poolt indutseeritud autofaagiale nakatunud rakkudes.

Põletikuvastuse iseloomustamine

H. pylori infektsioon vallandab mao epiteelirakkudes jõulise põletikulise vastuse, mis kroonilisel kujul aitab kaasa kantserogeneesile. IL-8 indutseerimine on infektsiooni peamine tunnusjoon, mis värbab neutrofiile ja säilitab koepõletiku.

IL-8 sekretsiooni kvantifitseerimine ELISA-meetodil kultuuride supernatantidesse võimaldab põletikulise aktivatsiooni tundlikku ja suure läbilaskevõimega mõõtmist. CagA-positiivsete tüvedega nakatunud AGS-rakkudes on IL-8 produktsioon võrreldes CagA-negatiivsete tüvedega või nakatumata kontrollidega märkimisväärselt suurenenud.

NF-κB aktivatsioon juhib IL-8 ja teiste põletikugeenide ekspressiooni. P65/RelA tuuma translokatsiooni saab jälgida immunofluorestsentsiga või tuuma/tsütoplasma fraktsioneerimise ja sellele järgneva Western blotting'i abil. NF-κB vastuselemendid sisaldavad reporterkonstruktsioonid annavad kvantitatiivseid transkriptsiooninäitajaid.

COX-2 ülereguleerimine H. pylori poolt soodustab prostaglandiin E2 tootmist, suurendades proliferatsiooni ja pärssides apoptoosi. COX-2 inhibiitorid on osutunud paljulubavaks H. pylori poolt põhjustatud maovähi ennetamisel eksperimentaalsetes mudelites.

Pikaajaline infektsioon ja kantserogeenne transformatsioon

Ägeda infektsiooni uuringud kajastavad vahetut rakulist reaktsiooni, kuid kartsinogenees nõuab kroonilist kokkupuudet bakteriaalsete teguritega. Pikaajalised kooskultuuriprotokollid või korduvad nakkustsüklid võivad modelleerida püsivat kokkupuudet, mis toimub loomuliku nakkuse ajal.

Epigeneetilised muutused, sealhulgas DNA metüülimuutused, akumuleeruvad kroonilise H. pylori infektsiooni ajal. Bisulfiitse sekveneerimine või metüülimustrid näitavad kasvajate supressorite promootorite progressiivset hüpermetüleerimist, mis võib püsida isegi pärast bakterite hävitamist.

Transformatsioonitestid, sealhulgas pehmete agar-kolooniate moodustamine ja ksenotransplantaadi tumorigeensus, võimaldavad hinnata, kas pikaajaline infektsioon annab tumorigeenseid omadusi. Need funktsionaalsed lõpp-punktid annavad kõige rangemad tõendid infektsioonist põhjustatud kantserogeneesi kohta.

Soovitatavad tooted H. pylori infektsiooni uurimiseks:

• AGS Cells (300408) - parim maovähi mudel H. pylori uuringute jaoks
• DMEM High Glucose (820300a) - standardkultuurikeskkond
• Freeze medium CM-ACF (800650) - krüokonserveerimislahus