SNU-1 Cells in Helicobacter pylori Infection Studies

A Helicobacter pylori-fertőzés a világ népességének körülbelül felét érinti, és a gyomor adenokarcinóma - egy rosszindulatú, rossz prognózisú és korlátozott kezelési lehetőségekkel rendelkező rosszindulatú daganat - legerősebb ismert kockázati tényezője. A Cytionnál felismertük, hogy azon molekuláris mechanizmusok megértéséhez, amelyekkel ez a baktérium elősegíti a karcinogenezist, olyan robusztus sejtmodellekre van szükség, amelyek hűen reprodukálják a gyomor epithelialis válaszát a fertőzésre. A gyomorrákos koreai betegből származó SNU-1 sejtek alapvető platformot biztosítanak a H. pylori-gazda kölcsönhatások tanulmányozásához és a fertőzéssel összefüggő rákos megbetegedések kialakulásának megelőzésére irányuló terápiás stratégiák azonosításához.

A legfontosabb tudnivalók

• Az SNU-1 sejtek fenntartják a gyomor epiteliális jellemzőit, amelyek nélkülözhetetlenek a H. pylori fertőzés modellezéséhez
• A CagA-transzlokáció és a VacA-toxin hatása tanulmányozható gyomorrákos sejtmodellekben
• A gyulladásos jelátviteli kaszkád aktivációja in vivo fertőzési válaszokat tükröz
• A krónikus fertőzés által indukált epigenetikai változások a karcinogén transzformáció motorjai
• Gyógyszeres szűrés azonosítja a fertőzés által kiváltott onkogén jelátvitelt gátló szereket

Gyomorrák sejtvonal kiválasztása H. pylori vizsgálatokhoz

A H. pylori-gazda interakciók tanulmányozásához olyan sejtvonalakra van szükség, amelyek fenntartják a gyomor epiteliális jellemzőit, beleértve a baktériumok adhéziójához szükséges receptorok megfelelő expresszióját és a virulenciafaktorokra reagáló funkcionális jelátviteli útvonalakat. A koreai betegekből származó SNU gyomorrákvonalak jól jellemzett modelleket biztosítanak a fertőzésvizsgálatokhoz.

A H. pylori-kutatásban az AGS-sejtjeink (300408 ) jelentik a fertőzési vizsgálatokhoz legszélesebb körben használt gyomor adenokarcinóma modellt. Ezek a sejtek hatékonyan internalizálják a CagA fehérjét és erőteljes gyulladásos jelátviteli válaszokat mutatnak, így ideálisak a virulenciafaktorok mechanizmusainak tanulmányozására.

Az AGS sejtek a H. pylori kötődéséhez szükséges adhéziós molekulákat expresszálják, és rendelkeznek a gyulladásos génindukcióhoz nélkülözhetetlen NF-κB jelátviteli útvonalakkal. Jól jellemzett természetük és kiterjedt irodalmi támogatásuk megkönnyíti a kísérletek tervezését és az eredmények értelmezését.

CagA transzlokáció és onkogén jelátvitel

A CagA fehérje képviseli a legjobban jellemzett H. pylori virulencia faktort, amely közvetlenül összekapcsolja a fertőzést a karcinogenezissel. A cag patogenitási szigetet (cag PAI) birtokló törzsek a CagA-t egy IV-es típusú szekréciós rendszeren keresztül juttatják be a gazdasejtekbe, ahol tirozin-foszforiláción megy keresztül, és eltéríti a gazdaszervezet jelátviteli útvonalait.

A gyomorhámsejtekbe történő transzlokáció után a CagA-t a Src-család kinázai foszforilálják az EPIYA-motívumokon. A foszforilált CagA megköti és aktiválja az SHP-2 foszfatázt, ami tartós ERK/MAPK jelátvitelt, sejtszóródást és a fertőzött AGS sejtkultúrákban könnyen megfigyelhető jellegzetes "kolibri" morfológiát eredményez.

A CagA foszforiláció-független hatásokat is kifejt a sejtek polaritásának megzavarásával a PAR1b/MARK kinázokkal és a tight junction fehérjékkel való kölcsönhatás révén. Ez a polaritási zavar hozzájárul a krónikus H. pylori-fertőzéssel járó epiteliális gát diszfunkciójához és a sejtek átalakulásához.

A CagA-transzlokáció nyomon követése anti-foszfo-CagA antitestek vagy CagA-GFP fúziós konstrukciók segítségével lehetővé teszi a baktériumszállítás hatékonyságának kvantitatív értékelését. A fertőzött sejtlízisek Western blottingja feltárja a jellegzetes foszforilált CagA sávmintázatot, amely az EPIYA-motívum foszforilációját tükrözi.

VacA által közvetített sejttoxicitás

A vákuolizáló citotoxin A (VacA) egy másik fontos H. pylori virulenciafaktort képvisel, amely többfunkciós hatással van a gazdasejtekre. A CagA-tól eltérően a VacA szekretálódik, és mind a fertőzött, mind a kívülálló sejtekre képes hatni, hozzájárulva a szövetkárosodáshoz és az immunmodulációhoz.

A VacA jellegzetes hatása a késői endoszómális kompartmentumokból származó nagy intracelluláris vakuolumok képződése. A vakuoláció fáziskontrasztmikroszkópiával vagy semleges vörös festéssel könnyen láthatóvá tehető, és a vakuolumokat nyomon követő festékeket használó áramlási citometriával számszerűsíthető.

A VacA a mitokondriumokat is célba veszi, citokróm c felszabadulást és apoptózist indukálva. Ezt a mitokondriális toxicitást membránpotenciál-mérésekkel (JC-1, TMRE), kaszpáz-aktivációs vizsgálatokkal és az apoptotikus sejthalált jelző Annexin V festéssel lehet értékelni.

A VacA autofágiát indukáló tulajdonságai hozzájárulhatnak a baktériumok perzisztenciájához azáltal, hogy megakadályozzák az internalizált baktériumok teljes lebomlását. Az LC3 puncta képződése és a p62 degradációja a VacA által indukált autofágia markerei a fertőzött sejtekben.

Gyulladásos válasz jellemzése

A H. pylori-fertőzés erőteljes gyulladásos válaszokat vált ki a gyomor epitélsejtjeiben, amelyek krónikusan hozzájárulnak a karcinogenezishez. Az IL-8 indukció a fertőzés kardinális jellemzője, amely neutrofileket toboroz és állandósítja a szöveti gyulladást.

Az IL-8 tenyésztési felülúszókba történő szekréciójának ELISA-kvantitatív meghatározása a gyulladásos aktiváció érzékeny, nagy áteresztőképességű leolvasását teszi lehetővé. A CagA-pozitív törzsekkel fertőzött AGS sejtek drámaian megnövekedett IL-8 termelést mutatnak a CagA-negatív törzsekhez vagy a nem fertőzött kontrollokhoz képest.

Az NF-κB aktiváció irányítja az IL-8 és más gyulladásos gének expresszióját. A p65/RelA nukleáris transzlokációja immunfluoreszcenciával vagy nukleáris/citoplazmatikus frakcionálással, majd western blottinggal nyomon követhető. Az NF-κB válaszelemeket tartalmazó riporterkonstrukciók kvantitatív transzkripciós leolvasást biztosítanak.

A COX-2 H. pylori általi felszabályozása elősegíti a prosztaglandin E2 termelést, fokozza a proliferációt és elnyomja az apoptózist. A COX-2 gátlók ígéretesnek bizonyultak a H. pylori által okozott gyomorrák megelőzésében kísérleti modellekben.

Hosszú távú fertőzés és karcinogén transzformáció

Az akut fertőzési vizsgálatok azonnali sejtválaszokat rögzítenek, de a karcinogenezishez krónikus expozícióra van szükség a bakteriális tényezőkkel szemben. Kiterjesztett ko-kultúra protokollok vagy ismételt fertőzési ciklusok modellezhetik a természetes fertőzés során előforduló tartós expozíciót.

A krónikus H. pylori-fertőzés során epigenetikai változások, beleértve a DNS-metilációs változásokat is, felhalmozódnak. A biszulfit-szekvenálás vagy a metilációs tömbök a tumorszupresszor promóterek progresszív hipermetilációját mutatják ki, amely a baktérium kiirtása után is fennmaradhat.

A transzformációs vizsgálatok, beleértve a lágy agar kolóniaképzést és a xenograft tumorigenitást, felmérhetik, hogy a hosszan tartó fertőzés kölcsönöz-e tumorigén tulajdonságokat. Ezek a funkcionális végpontok szolgáltatják a legszigorúbb bizonyítékot a fertőzés által kiváltott karcinogenezisre.

Ajánlott termékek a H. pylori fertőzés kutatásához:

• AGS-sejtek (300408) - A H. pylori-vizsgálatok első számú gyomorrákmodellje
• DMEM High Glucose (820300a) - Standard táptalaj
• CM-ACF (800650) - kriokonzerváló oldat