SNU-1 Cells in Helicobacter pylori Infection Studies

ヘリコバクター・ピロリ感染症は、世界人口の約半数が罹患しており、予後不良で治療選択肢が限られている悪性腫瘍である胃腺がんの最も強力なリスク因子として知られています。サイシオンでは、ピロリ菌が発がんを促進する分子メカニズムを理解するためには、感染に対する胃上皮の反応を忠実に再現した強固な細胞モデルが必要であると認識しています。韓国の胃がん患者由来のSNU-1細胞は、H. pylorと宿主の相互作用を研究し、感染に関連したがん発生を予防する治療戦略を同定するために不可欠なプラットフォームとなります。

要点

• SNU-1細胞はピロリ菌感染のモデル化に不可欠な胃上皮の特徴を維持している
• 胃がん細胞モデルでCagAトランスロケーションとVacA毒素の効果を研究できる
• 炎症シグナル伝達カスケードの活性化はin vivo感染応答を反映する
• 慢性感染によって誘発されるエピジェネティックな変化が発癌性形質転換を促進する
• 感染によって誘導される発癌シグナル伝達を阻害する薬剤が薬剤スクリーニングによって同定される

ピロリ菌研究のための胃癌細胞株の選択

ピロリ菌と宿主の相互作用を研究するには、細菌接着のための適切なレセプター発現や病原性因子に反応する機能的シグナル伝達経路など、胃上皮の特徴を維持する細胞株が必要である。韓国人患者由来のSNU胃癌細胞株は、感染研究のためのよく特徴付けられたモデルとなる。

ピロリ菌の研究においては、当社のAGS細胞（300408）が、感染研究のために最も広く使用されている胃腺癌モデルである。これらの細胞はCagAタンパク質を効率的に内在化し、強固な炎症シグナル応答を示すため、病原性因子のメカニズムを研究するのに理想的です。

AGS細胞はピロリ菌の接着に必要な接着分子を発現し、炎症性遺伝子の誘導に不可欠なNF-κBシグナル伝達経路をそのまま持っている。そのよく特徴付けられた性質と広範な文献的サポートにより、実験デザインと結果の解釈が容易になる。

CagAトランスロケーションと発癌性シグナル伝達

CagAタンパク質はH. pyloriの病原性因子の中で最も特徴的なものであり、感染と発癌を直接結びつけている。cag病原性アイランド（cag PAI）を持つ株は、CagAをIV型分泌系を介して宿主細胞に注入し、そこでチロシンリン酸化を受けて宿主のシグナル伝達経路を乗っ取る。

胃上皮細胞に移行すると、CagAはSrcファミリーキナーゼによってEPIYAモチーフでリン酸化される。リン酸化されたCagAはSHP-2ホスファターゼと結合して活性化され、持続的なERK/MAPKシグナル伝達、細胞散乱、感染したAGS細胞培養で容易に観察される特徴的な「ハミングバード」形態をもたらす。

CagAはまた、PAR1b/MARKキナーゼやタイトジャンクションタンパク質との相互作用を通して細胞の極性を破壊することにより、リン酸化に依存しない効果を発揮する。この極性の破壊は、ピロリ菌の慢性感染に伴う上皮バリア機能障害と細胞の形質転換に寄与している。

抗ホスホCagA抗体またはCagA-GFP融合コンストラクトを用いてCagAのトランスロケーションをモニターすることにより、細菌の送達効率を定量的に評価することができる。感染細胞溶解液のウェスタンブロッティングにより、EPIYAモチーフのリン酸化を反映する特徴的なリン酸化CagAバンドパターンが明らかになった。

VacAを介した細胞毒性

Vacuolating cytotoxin A (VacA)は、宿主細胞に対して多機能的な作用を持つもう一つのH. pyloriの主要な病原因子である。CagAとは異なり、VacAは分泌性であり、感染細胞とバイスタンダー細胞の両方に作用し、組織障害と免疫調節に寄与する。

VacAの特徴的な作用は、後期エンドソームコンパートメントに由来する大きな細胞内液胞の形成である。液胞化は位相差顕微鏡やニュートラルレッド染色によって容易に可視化され、液胞追跡色素を用いたフローサイトメトリーによって定量することができる。

VacAはミトコンドリアも標的にし、シトクロムcの放出とアポトーシスを誘導する。このミトコンドリア毒性は、膜電位測定（JC-1、TMRE）、カスパーゼ活性化アッセイ、アポトーシス細胞死のためのアネキシンV染色によって評価できる。

VacAのオートファジー誘導特性は、内在化した細菌の完全な分解を妨げることにより、細菌の持続性に寄与している可能性がある。LC3点刻形成とp62分解は、感染細胞におけるVacA誘導オートファジーのマーカーとなる。

炎症反応の特徴

ピロリ菌感染は胃の上皮細胞に強い炎症反応を引き起こし、慢性化すると発癌の一因となる。IL-8の誘導は感染の主要な特徴であり、好中球を動員して組織の炎症を持続させる。

培養上清へのIL-8分泌をELISAで定量することにより、炎症活性化の高感度、高スループットの読み出しが可能となる。CagA陽性株に感染したAGS細胞は、CagA陰性株や感染していないコントロールに比べてIL-8産生が劇的に上昇している。

NF-κBの活性化はIL-8や他の炎症性遺伝子の発現を促進する。p65/RelAの核移行は、免疫蛍光法あるいは核/細胞質分画とウェスタンブロッティングによってモニターすることができる。NF-κB応答エレメントを含むレポーター構築物は、定量的な転写の読み出しを提供する。

ピロリ菌によるCOX-2のアップレギュレーションは、プロスタグランジンE2の産生を促進し、増殖を亢進し、アポトーシスを抑制する。COX-2阻害剤は、実験モデルにおいてピロリ菌関連胃癌の予防に有望である。

長期感染と発癌性形質転換

急性感染研究は即時的な細胞応答を捉えているが、発癌には細菌因子への慢性的な曝露が必要である。長期にわたる共培養プロトコールや反復感染サイクルは、自然感染時に生じる持続的な曝露をモデル化することができる。

DNAメチル化変化を含むエピジェネティックな変化は、ピロリ菌の慢性感染中に蓄積する。Bisulfiteシークエンシングやメチル化アレイにより、除菌後も持続する可能性のある腫瘍抑制プロモーターの漸進的なメチル化亢進が明らかになる。

軟寒天コロニー形成や異種移植による腫瘍形成性を含む形質転換アッセイは、長期間の感染が腫瘍形成性をもたらすかどうかを評価することができる。これらの機能的エンドポイントは、感染による発がんについて最も厳密な証拠を提供する。

ピロリ菌感染研究に推奨される製品

• AGS Cells (300408)- ピロリ菌研究のためのプレミア胃がんモデル
• DMEM High Glucose (820300a)- 標準培地
• 凍結培地 CM-ACF（800650）- 凍結保存液