SNU-1 Cells in Helicobacter pylori Infection Studies

Helicobacter pylori infekcija skar aptuveni pusi pasaules iedzīvotāju un ir spēcīgākais zināmais riska faktors kuņģa adenokarcinomai - ļaundabīgam audzējam ar sliktu prognozi un ierobežotām ārstēšanas iespējām. Uzņēmumā Cytion mēs apzināmies, ka, lai izprastu molekulāros mehānismus, ar kuru palīdzību šī baktērija veicina kanceroģenēzi, ir nepieciešami stabili šūnu modeļi, kas precīzi atveido kuņģa epitēlija reakciju uz infekciju. SNU-1 šūnas, kas iegūtas no Korejas pacienta ar kuņģa karcinomu, ir būtiska platforma H. pylor un saimnieka mijiedarbības izpētei un terapeitisko stratēģiju identificēšanai, lai novērstu ar infekciju saistītu vēža attīstību.

Galvenie secinājumi

• SNU-1 šūnas saglabā kuņģa epitēlija īpašības, kas ir būtiskas H. pylori infekcijas modelēšanai
• CagA translokāciju un VacA toksīna iedarbību var pētīt kuņģa vēža šūnu modeļos
• Iekaisuma signalizācijas kaskādes aktivizācija atspoguļo in vivo infekcijas reakcijas
• Hroniskas infekcijas izraisītas epiģenētiskās izmaiņas veicina kancerogēno transformāciju
• Veicot zāļu skrīningu, identificēti līdzekļi, kas bloķē infekcijas izraisīto onkogēno signalizāciju

Kuņģa vēža šūnu līniju atlase H. pylori pētījumiem

H. pylor un saimnieka mijiedarbības izpētei nepieciešamas šūnu līnijas, kas saglabā kuņģa epitēlija īpašības, tostarp atbilstošu receptoru ekspresiju baktēriju adhēzijai un funkcionālus signalizācijas ceļus, kas reaģē uz virulences faktoriem. SNU kuņģa vēža līnijas, kas iegūtas no Korejas pacientiem, ir labi raksturoti modeļi infekcijas pētījumiem.

H. pylori pētījumiem mūsu AGS šūnas (300408 ) ir visplašāk izmantotais kuņģa adenokarcinomas modelis infekcijas pētījumiem. Šīs šūnas efektīvi internalizē CagA proteīnu un demonstrē spēcīgas iekaisuma signālu reakcijas, tāpēc tās ir ideāli piemērotas virulences faktoru mehānismu izpētei.

AGS šūnas ekspresē adhēzijas molekulas, kas nepieciešamas H. pylori pieķeršanai, un tām ir neskarti NF-κB signalizācijas ceļi, kas ir būtiski iekaisuma gēnu indukcijai. To labi raksturotais raksturs un plašais literatūras klāsts atvieglo eksperimentu plānošanu un rezultātu interpretāciju.

CagA translokācija un onkogēnā signalizācija

CagA proteīns ir visprecīzāk raksturotais H. pylori virulences faktors, kas tieši saista infekciju ar kanceroģenēzi. Šķirnes, kurām piemīt cag patogenitātes sala (cag PAI), ar IV tipa sekrēcijas sistēmas palīdzību ievada CagA saimnieka šūnās, kur tas tiek pakļauts tirozīna fosforilēšanai un pārņem saimnieka signalizācijas ceļus.

Pēc pārvietošanas kuņģa epitēlija šūnās CagA fosforilē Src dzimtas kināzes pie EPIYA motīviem. Fosforilētais CagA saistās un aktivizē SHP-2 fosfatāzi, izraisot ilgstošu ERK/MAPK signalizāciju, šūnu izkliedi un raksturīgo "kolibri" morfoloģiju, kas viegli novērojama inficētajās AGS šūnu kultūrās.

CagA iedarbojas arī neatkarīgi no fosforilēšanas, izjaucot šūnu polaritāti, mijiedarbojoties ar PAR1b/MARK kināzēm un ciešo savienojumu proteīniem. Šī polaritātes traucēšana veicina epitēlija barjeras disfunkciju un šūnu transformāciju, kas saistīta ar hronisku H. pylori infekciju.

CagA pārvietošanas uzraudzība, izmantojot anti-fosfo-CagA antivielas vai CagA-GFP fusion konstrukcijas, ļauj kvantitatīvi novērtēt baktēriju piegādes efektivitāti. Inficēto šūnu lizātu Western blotting atklāj raksturīgo fosforilētu CagA joslu, kas atspoguļo EPIYA motīva fosforilēšanu.

VacA izraisītā šūnu toksicitāte

Vakuolējošais citotoksīns A (VacA) ir vēl viens nozīmīgs H. pylori virulences faktors ar daudzfunkcionālu iedarbību uz saimnieka šūnām. Atšķirībā no CagA VacA tiek izdalīts un var iedarboties gan uz inficētajām, gan blakus esošajām šūnām, veicinot audu bojājumus un imūnmodulāciju.

VacA raksturīgā iedarbība ir lielu intracelulāro vakuolu veidošanās, kas rodas no vēlajiem endosomu nodalījumiem. Vakuolācija ir viegli vizualizējama, izmantojot fāzu kontrasta mikroskopiju vai neitrāli sarkano krāsojumu, un to var kvantitatīvi noteikt ar plūsmas citometrijas metodi, izmantojot vakuolu izsekošanas krāsvielas.

VacA iedarbojas arī uz mitohondrijiem, izraisot citohroma c izdalīšanos un apoptozi. Šo mitohondriālo toksicitāti var novērtēt, veicot membrānas potenciāla mērījumus (JC-1, TMRE), kaspāžu aktivācijas testus un Annexin V krāsošanu, lai noteiktu šūnu apoptozes nāvi.

VacA autofagiju veicinošās VacA īpašības var veicināt baktēriju noturību, novēršot internalizēto baktēriju pilnīgu noārdīšanos. LC3 punktu veidošanās un p62 degradācija ir marķieri VacA izraisītajai autofāģijai inficētajās šūnās.

Iekaisuma reakcijas raksturojums

H. pylori infekcija izraisa spēcīgu iekaisuma reakciju kuņģa epitēlija šūnās, kas hroniskā formā veicina kanceroģenēzi. IL-8 indukcija ir galvenā infekcijas pazīme, kas piesaista neitrofīlus un pastiprina audu iekaisumu.

ELISA kvantitatīva IL-8 sekrēcijas noteikšana kultūru supernatantos nodrošina jutīgu, augstas izšķirtspējas iekaisuma aktivācijas nolasīšanu. AGS šūnām, kas inficētas ar CagA pozitīviem celmiem, ir ievērojami paaugstināta IL-8 produkcija salīdzinājumā ar CagA negatīviem celmiem vai neinficētām kontrolšūnām.

NF-κB aktivācija veicina IL-8 un citu iekaisuma gēnu ekspresiju. Kodola p65/RelA pārvietošanu var kontrolēt ar imunofluorescenci vai kodola/citoplazmas frakcionēšanu, kam seko rietumu blotings. Reportieru konstrukcijas, kas satur NF-κB atbildes elementus, nodrošina kvantitatīvus transkripcijas rādījumus.

H. pylori izraisīta COX-2 upregulācija veicina prostaglandīna E2 veidošanos, veicinot proliferāciju un nomācot apoptozi. COX-2 inhibitori ir daudzsološi ar H. pylori saistīta kuņģa vēža profilaksei eksperimentālos modeļos.

Ilgtermiņa infekcija un kancerogēna transformācija

Akūtas inficēšanās pētījumi atspoguļo tūlītēju šūnu reakciju, bet kanceroģenēzei nepieciešama hroniska baktēriju faktoru iedarbība. Ilgstoši kopkultūru protokoli vai atkārtoti infekcijas cikli var modelēt pastāvīgu iedarbību, kas rodas dabiskas infekcijas laikā.

H. pylori hroniskas infekcijas laikā uzkrājas epiģenētiskas izmaiņas, tostarp DNS metilēšanas izmaiņas. Bisulfīta sekvencēšana vai metilācijas masīvi atklāj progresējošu audzēju supresoru promotoru hipermetilāciju, kas var saglabāties pat pēc baktēriju izskaušanas.

Ar transformācijas testiem, tostarp mīksta agara koloniju veidošanos un ksenogrāfta tumorogēniskumu, var novērtēt, vai ilgstoša infekcija piešķir tumorogēnas īpašības. Šie funkcionālie galīgie rādītāji sniedz visprecīzākos pierādījumus par infekcijas izraisītu kancerogēnozi.

Ieteicamie produkti H. pylori infekcijas izpētei:

• AGS šūnas (300408) - galvenais kuņģa vēža modelis H. pylori infekcijas pētījumiem
• DMEM ar augstu glikozes saturu (820300a) - standarta barotne
• Saldēšanas barotne CM-ACF (800650) - Kriokonservēšanas šķīdums