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Aplicações

Descoberta de medicamentos e triagem terapêutica para o osteossarcoma

A linha celular U2OS é a principal ferramenta para a avaliação de compostos novos e redirecionados contra o osteossarcoma. Estudos examinaram as atividades antitumorais de diversos agentes naturais e sintéticos nessa linha. A curcina C, uma proteína inativadora de ribossomos do tipo I proveniente de sementes de Jatropha curcas pós-germinação, demonstrou inibir a proliferação celular da U2OS por meio de apoptose mediada por ROS, autofagia e parada nas fases S e G2/M, com o efeito atribuído à ativação da via de sinalização JNK juntamente com a inibição da via ERK; o eliminador de ROS NAC e o inibidor de JNK SP600125, cada um, atenuaram a resposta, corroborando a cascata proposta [53]. Um estudo de acompanhamento mostrou que a maior potência da Curcina C em relação à Curcina nas células U2OS se explica em grande parte pela endocitose dependente de clatrina mediada por LRP1, que está disponível para a Curcina C, mas não para a Curcina.

A aloperina, um produto natural alcalóide, suprimiu a proliferação e a clonogenicidade das células de osteossarcoma MG-63 e U2OS, induziu a apoptose — conforme confirmado por citometria de fluxo — e inibiu a invasão em ensaios de scratch e transwell, com regulação negativa de MMP-2, MMP-9, PI3K e p-AKT1 [54]. Esse estudo destacou múltiplas vias convergentes pelas quais alcalóides naturais poderiam simultaneamente prejudicar o crescimento e o potencial metastático. De forma independente, demonstrou-se que o metabolito do adoçante natural esteviol inibe a proliferação das células U2OS de maneira dependente da dose e do tempo; uma investigação mecanística revelou parada do ciclo celular na fase G1 e uma via apoptótica mitocondrial indicada por um aumento na relação Bax/Bcl-2 [55] — descobertas que posicionam os metabólitos naturais como candidatos para pesquisas em quimioprevenção do osteossarcoma.

O ácido tânico potencializou o efeito citotóxico da cisplatina nas células U2OS, mas a interação revelou-se fortemente dependente da proporção: observou-se sinergia nas proporções de ácido tânico para cisplatina de 90:10 e 85:15, enquanto as proporções de 75:25 e 50:50 foram antagônicas, e o ácido tânico isoladamente não inibiu significativamente os osteoblastos normais hFOB 1.19 [56]. Qualquer estratégia de sensibilização baseada em polifenóis depende, portanto, da otimização cuidadosa da proporção de doses, em vez da simples coadministração. O ácido gálico, de forma semelhante, potencializou a morte celular induzida pelo olaparibe e atenuou a resistência adquirida ao olaparibe em células U2OS e em uma linhagem derivada resistente ao olaparibe (U2OS-PIR), inibindo a angiogênese e modulando cPARP, Bcl-2 e Bax [57], ampliando o repertório de combinações de compostos naturais aplicáveis à pesquisa sobre o tratamento do osteossarcoma. O lenvatinibe, um inibidor multiquinase aprovado, demonstrou induzir alterações relacionadas à ferroptose nas células U2OS e 143B por meio de um eixo p-STAT3/p53/xCT, revelando um novo mecanismo pelo qual esse agente pode suprimir a progressão do osteossarcoma além de seu papel canônico de inibição da angiogênese [19]. A imunoterapia baseada em células natural killer (NK) foi avaliada contra um painel de linhagens de osteossarcoma, incluindo a U2OS, com a expressão do ligante NKG2D se correlacionando com a eficiência de morte celular mediada por NK e a interleucina-2 em aerossol melhorando a atividade das células NK específicas para órgãos in vivo [20].

Uma triagem mais ampla de medicamentos para sarcomas, abrangendo 63 linhagens humanas e mais de 400 compostos oncológicos, documentou os perfis de sensibilidade à medicação da U2OS juntamente com dados de expressão gênica e de microRNA, fornecendo uma rica referência farmacogenômica para a área [21]. O projeto pioneiro Cancer Cell Line Encyclopedia integrou dados de expressão gênica, número de cópias e sequenciamento de quase 950 linhagens, incluindo a U2OS, e correlacionou esses dados com perfis de sensibilidade a medicamentos para identificar biomarcadores preditivos de resposta [15]. Um estudo de panorama farmacogenômico subsequente mapeou associações de sensibilidade a medicamentos com alterações induzidas pelo câncer em mais de 1.000 linhagens anotadas, contextualizando ainda mais as respostas da U2OS no âmbito mais amplo da oncologia [22].

O eixo miR-16-1-3p/MDM2/p53 surgiu como um importante regulador da sinalização do TGF-β1 no osteossarcoma. Xue et al. demonstraram que a superexpressão de miR-16-1-3p reduziu significativamente o potencial proliferativo e clonogênico das células U2OS, enquanto sua combinação com o tratamento com TGF-β aumentou fortemente a parada na fase G1 e praticamente eliminou a capacidade de crescimento tumoral [23]. O mesmo estudo mostrou que o miR-16-1-3p inibiu a remodelação da actina induzida pelo TGF-β e as alterações associadas à transição epitelial-mesenquimal, e que a coadministração aumentou a sensibilidade à cisplatina em células U2OS do tipo selvagem e reduziu o volume dos nódulos tumorais e a metástase no modelo da membrana corioalantóica de pintinho, fornecendo uma compreensão mecanicista de como esse microRNA suprime o braço pró-metastático da sinalização do TGF-β. Demonstrou-se que as vesículas extracelulares derivadas de osteoblastos (OB-EVs) alteram o comportamento das células de osteossarcoma de maneira dependente da linhagem: nas células U2OS, elas reduziram a atividade metabólica (1,30 vezes) e a proliferação (1,70 vezes), ao mesmo tempo em que aumentaram a apoptose (1,15 vezes), enquanto a proliferação das células MG-63 aumentou 4,9 vezes. O perfil transcriptômico associado foi realizado em células MNNG/HOS, nas quais 296 genes apresentaram expressão diferencial, e os autores propõem o transporte de miRNA como um mecanismo potencialmente contribuinte que ainda requer validação funcional [24]. A reprogramação metabólica no osteossarcoma foi explorada por meio da transcriptômica de célula única, identificando a estanniocalcina-2 (STC2) como um regulador glicolítico central, validado funcionalmente nas células MG-63 e U2OS por meio da análise de fluxo extracelular Seahorse [25].

Reparo do DNA, regulação do ciclo celular e resposta a danos no DNA

A linha celular U2OS é um dos modelos mais amplamente utilizados na pesquisa sobre reparo do DNA, em grande parte porque seu p53 de tipo selvagem permite que toda a gama de respostas a danos dependentes do p53 seja investigada. Um estudo em escala genômica mapeou o transcriptoma regulado pelo ciclo celular das células U2OS, identificando 2.140 transcritos expressos periodicamente, correspondentes a 1.871 genes únicos ao longo de múltiplos ciclos celulares síncronos [52]. Ao combinar o ChIP-seq para o fator de transcrição G2/M FOXM1 com dados publicados de ChIP-seq para E2F1, E2F4, E2F6, GABPA e do complexo DREAM, os autores demonstraram que o FOXM1 ativa fortemente os promotores dos genes da fase G2/M e ativa apenas fracamente aqueles induzidos na fase S, e que um conjunto central de genes do ciclo celular compartilhado entre as células U2OS e HeLa é ligado por múltiplos fatores de transcrição do ciclo celular. O conjunto de dados estabeleceu o U2OS como um segundo modelo humano caracterizado de forma independente para o mapeamento do transcriptoma do ciclo celular e continua sendo uma referência amplamente utilizada para estudos de regulação gênica do ciclo de divisão celular humano.

Mutações de ganho de função no PPM1D/Wip1 — a fosfatase que inativa o p53 — produzem uma Wip1 hiperativa e truncada no extremo C-terminal e comprometem o ponto de verificação G1 dependente do p53 após danos no DNA; O U2OS carrega esse alelo truncado (p.Arg458Ter) de forma heterozigótica [7] [61]. Isso torna o U2OS um modelo útil para estudar como as truncagens da Wip1 conferem uma vantagem seletiva de crescimento ao atenuar a resposta a danos no DNA. A variabilidade entre células individuais na resposta a danos no DNA foi quantificada em células U2OS expostas a 2 Gy de fótons; ao comparar os focos de 53BP1 e γH2AX em núcleos irmãos de células binucleadas, Płódowska et al. demonstraram ruído estocástico entre células na formação de focos de reparo, sobreposto a danos no DNA distribuídos aleatoriamente, com o ruído contribuindo com 28% da variabilidade total para os focos de 53BP1 e 50% para os focos de γH2AX [26]. A análise da troca de cromátides irmãs em linhagens de sarcoma de tecido mole, incluindo comparadores U2OS, confirmou que a formação endógena de γH2AX se correlaciona com a instabilidade genômica e pode prever respostas a tratamentos que causam danos ao DNA [27].

Células U2OS foram utilizadas para investigar a expansão somática da repetição CAG na doença de Huntington. A interrupção genética do bolsão de ligação do MSH3 Y245/K246 do MSH3, que se liga ao IDL, reduziu significativamente a interação com o DNA e inibiu a expansão da repetição em uma linhagem U2OS que expressava o exon 1 do HTT mutante; além disso, o bloqueio farmacológico do mesmo local reduziu a expansão da repetição em U2OS e, mais importante, também retardou a expansão em neurônios espinhosos médios derivados de iPSCs de pacientes com doença de Huntington [28]. A linhagem derivada U2OS DR-GFP tem sido amplamente utilizada para ensaios de reparo por recombinação homóloga, e múltiplas linhagens knockout — incluindo as de RAD52, TBK1 e OPTN — foram geradas para analisar componentes específicos da via de reparo, todas catalogadas como entradas filhas de CVCL_0042 [61]. O supressor tumoral TSC2 foi identificado como um supressor de grânulos de estresse; em um pré-impresso que relata esse trabalho, a redução parcial de TSC2 mediada por siRNA em células U2OS não induziu grânulos de estresse espontâneos, em contraste com a perda completa observada em fibroblastos embrionários de camundongo, estabelecendo o TSC2 como um regulador dependente de limiar da montagem de grânulos de estresse [29]. Triagens em todo o genoma para deleções homozigotas e alterações nos genes do complexo de polaridade em painéis de linhagens celulares cancerosas também incorporaram dados de U2OS, contribuindo para a identificação de genes cancerígenos recessivos e assinaturas de sítios frágeis [30] [31].

Biologia circadiana e regulação gênica

As células U2OS tornaram-se um modelo de referência para pesquisas sobre o relógio circadiano de mamíferos. Elas exibem ritmos circadianos robustos e autossustentáveis e são rotineiramente utilizadas com repórteres de luciferase de genes do relógio para luminometria em tempo real. Burke et al. utilizaram células U2OS que expressam repórteres de luciferase de genes do relógio para demonstrar que a cafeína prolonga o período circadiano de maneira dependente da dose e estabeleceram, por meio de análise farmacológica e supressão por siRNA, que a sinalização do receptor de adenosina — e não a atividade do receptor de rianodina ou da fosfodiesterase — é responsável pelo efeito [59]. O mesmo sistema permite a triagem química em grande escala: uma triagem de alto rendimento de medicamentos existentes em células U2OS revelou que aproximadamente 5% alteraram o período circadiano, identificando a desidroepiandrosterona como um composto que encurta o período e implicando ABL1, ABL2 e a quinase BCR na regulação do período [60]. Essas propriedades têm sido amplamente exploradas para caracterizar os mecanismos moleculares que regem o ciclo central de retroalimentação transcrição-tradução BMAL1/CLOCK e suas interações com vias oncogênicas.

Um pré-print recente investigou a natureza circadiana endógena do c-MYC em células U2OS. Ao gerar um repórter de c-MYC e comparar sua fase de oscilação com os repórteres de BMAL1 e PER2, Kalyanaraman et al. relataram que o promotor de c-MYC oscila ritmicamente em U2OS — uma linhagem com níveis inerentemente baixos de MYC — e oscila fora de fase em relação aos componentes centrais do relógio [32]. Um modelo computacional baseado nessas descobertas sugeriu que o MYC atua como um disruptor do relógio, cujo tempo de ação minimiza seu impacto negativo na regulação circadiana — uma descoberta com implicações para a compreensão de como a superexpressão oncogênica do MYC perturba a fisiologia circadiana. Por se tratar de um pré-impresso, este trabalho ainda não passou pela revisão por pares. No entanto, ele exemplifica a adequação da linha U2OS para investigar simultaneamente a função do oncogene e a regulação circadiana.

A U2OS é negativa para telomerase e mantém seus telômeros por meio do alongamento alternativo dos telômeros (ALT), o mecanismo baseado em recombinação documentado pela primeira vez em um subconjunto de tumores e linhagens celulares derivadas de tumores por Bryan et al. [58]. Isso a torna um modelo padrão para pesquisas sobre o ALT, um mecanismo ativo em um subconjunto de cânceres, incluindo osteossarcomas. A linhagem também é frequentemente empregada em estudos sobre a dinâmica das modificações das histonas, a arquitetura nuclear e a organização da cromatina, aproveitando seus núcleos grandes e sua facilidade de visualização óptica. Derivados de histonas e poros nucleares marcados com fluorescência — incluindo a U2OS EGFP-H2B e múltiplas linhagens NUP96 marcadas com CRISPR derivadas da U2OS — permitiram a imagem quantitativa da cromatina e dos processos de transporte nuclear com alta resolução espacial [61].

Endocitose e tráfego intracelular

A linha U2OS emergiu como um modelo padrão para o estudo da endocitose mediada por clatrina (CME) e da atividade da GTPase dinamina, devido à sua robusta atividade de internalização de receptores e à sua adequação para ensaios quantitativos de CME baseados em fluorescência, que medem a captação de transferrina-Alexa594. Uma série de compostos sulfonadínicos — arilsulfonamidas derivadas de análogos da dansilcadaverina — foi caracterizada como inibidores competitivos do GTP da dinamina I e da dinamina II, utilizando células U2OS como plataforma primária para ensaios de CME [33]. A análise cinética de Michaelis-Menten nesse sistema confirmou o mecanismo de inibição, e o análogo mais potente também exibiu atividade antiepiléptica em modelos animais, posicionando os ensaios de CME baseados em U2OS como uma ferramenta translacional para a descoberta de medicamentos neurológicos.

Separadamente, a bolinaquinona — um sesquiterpeno hidroxiquinônico de origem marinha — e análogos relacionados da naftoquinona foram avaliados quanto à atividade inibitória da CME em células U2OS, com a otimização estrutural orientada pela teoria do funcional da densidade resultando em análogos com potência substancialmente aprimorada tanto contra a GTPase da dinamina quanto contra a CME [34]. Esses estudos ilustram como os ensaios de CME baseados em U2OS servem como uma plataforma sensível e reproduzível para estudos de relação estrutura-atividade em inibidores da endocitose. A expressão consistente de receptores nessa linhagem e a cinética previsível de internalização a tornam um sistema celular preferencial para essa classe de pesquisa.

O destino dos oligonucleotídeos antissenso (ASOs) após a captação celular foi rastreado em células U2OS por meio de microscopia de células vivas, medições raciométricas de pH e microscopia eletrônica de varredura tridimensional com feixe de íons focado. Em um pré-artigo que relata este trabalho, Sitarska et al. demonstraram que, mesmo em condições que reduziam o RNA-alvo em mais de 90%, menos de 4% dos ASOs internalizados alcançavam o núcleo, e que os ASOs se acumulavam em endossomos tardios, endolisossomos e lisossomos, onde induziam neutralização luminal sem recrutamento de galectina-3 ou ruptura da membrana limitante [35]. Os autores propõem que a fuga produtiva ocorra, na verdade, em um estágio mais precoce da endocitose, provavelmente nos endossomos precoces ou de reciclagem. Células U2OS também foram utilizadas em um ensaio de ativação do GLP-1R — uma linhagem U2OS que expressa biossensores Nomad sensíveis ao AMPc — para avaliar os efeitos metabólicos de um extrato de bergamota formulado com fosfolipídios, demonstrando a utilidade da linhagem como uma plataforma de expressão de receptores modificada para a farmacologia de produtos naturais [36]. A tecnologia de cibrídeos para o estudo de mutações no DNA mitocondrial foi aprimorada por meio da validação de derivados recém-desenvolvidos livres de mtDNA (ρ0) das linhas HCT116, HT1080 e U2OS como linhas celulares receptoras para a geração de cibrídeos transmitochondriais [37].

Proteômica, Genômica e Plataformas Multi-ômicas

A U2OS tem sido uma linha celular de referência fundamental em iniciativas de proteômica em larga escala. O primeiro perfil proteômico dedicado da U2OS foi gerado por Niforou et al. utilizando eletroforese bidimensional em gel acoplada à espectrometria de massa MALDI: aproximadamente 3.000 pontos foram excisados de dois géis de 2-DE e analisados, resultando na identificação de 237 produtos gênicos distintos, entre os quais 11 proto-oncogenes relacionados ao estado canceroso da linhagem [16]. Trabalhos subsequentes baseados em espectrometria de massa quantificaram o proteoma absoluto dessa linhagem na interfase e na mitose — descrita na publicação como uma linhagem celular humana comumente utilizada e atribuída à U2OS no Cellosaurus —, revelando a expressão de pelo menos aproximadamente 10.000 proteínas que abrangem sete ordens de magnitude em abundância celular, chegando a 20 milhões de cópias por célula [38] [61]. A proteômica comparativa em onze linhagens celulares comuns mostrou que a U2OS compartilha um núcleo de proteínas expressas de forma ubíqua, ao mesmo tempo em que apresenta variação específica do tipo celular em subconjuntos funcionais [39].

A proteômica de superfície celular em larga escala, utilizando a tecnologia Cell Surface Capture, catalogou o surfaceoma da U2OS juntamente com outros 40 tipos de células humanas (41 tipos de células humanas e 31 de camundongos no total), fornecendo um recurso para a identificação de alvos de superfície farmacologicamente acessíveis [40]. Estudos de tipagem de HLA e previsão de neoepitopos incorporaram a linha U2OS para apoiar o desenvolvimento de alvos para imunoterapia contra o câncer [41] [42]. A caracterização por matriz de proteínas em fase reversa de mais de 650 linhagens celulares cancerosas incluiu a U2OS, demonstrando que os dados fosfoproteômicos oferecem poder preditivo para a sensibilidade a medicamentos além daquele disponível apenas a partir de medições de mRNA [43]. O mapa proteômico pan-oncológico, abrangendo 949 linhagens celulares, integrou ainda mais os dados proteômicos do U2OS com triagens de essencialidade por CRISPR e dados de resposta a medicamentos, revelando milhares de biomarcadores proteicos de vulnerabilidade ao câncer [44].

A caracterização do transcriptoma de 675 linhagens de células cancerosas por sequenciamento de RNA catalogou fusões gênicas, assinaturas de mutação e expressão de sequências não humanas na U2OS [45]. A caracterização CCLE de última geração expandiu o perfil para incluir dados de metilação de DNA, modificação de histonas, expressão de microRNA e splicing de RNA em 1.072 linhagens, com o U2OS contribuindo para análises integrativas das características moleculares subjacentes às respostas aos medicamentos [46]. A proteômica quantitativa do painel CCLE identificou desregulação de vias metabólicas no nível proteico que não era aparente apenas a partir de dados genômicos ou transcriptômicos [47]. A técnica de Cell Painting combinada com o Perfil Proteômico Térmico em células U2OS demonstrou ser uma estratégia poderosa para inferir o mecanismo de ação de medicamentos, integrando o perfil morfológico à detecção imparcial de alvos proteicos [17]. Os conjuntos de dados proteômicos do U2OS também são submetidos a um controle de qualidade no nível do viroma: um fluxo de trabalho de xenoproteômica para a detecção não direcionada de proteínas virais em dados proteômicos foi desenvolvido como uma etapa geral de triagem, com os autores recomendando que todo conjunto de dados proteômicos celulares seja testado quanto à presença de proteínas não humanas antes da publicação [48]. A análise epigenômica integrativa do osteossarcoma, incorporando as células U2OS, identificou 350 genes com aberrações genéticas e epigenéticas concordantes, aprofundando a compreensão do panorama regulatório que rege a progressão do tumor ósseo [49]. A expressão proteica em microarrays celulares também foi avaliada utilizando células U2OS incorporadas em matrizes de agarose, permitindo o perfil simultâneo de múltiplas linhagens celulares no formato de microarray de tecido [50]. As respostas precoces dos marcadores das células U2OS a extratos de um enxerto ósseo xenogênico revestido com ácido hialurônico foram caracterizadas por qRT-PCR: O RUNX2 apresentou regulação positiva de 2,61 vezes (p = 0,01), enquanto nenhum efeito significativo foi relatado para o COL1A1, e as diferenças observadas na atividade metabólica não permaneceram significativas após a correção por FDR [51]. Os autores descrevem o estudo como exploratório e solicitam sua validação em células primárias e em modelos in vivo.

Conclusão

A U2OS (CVCL_0042) é uma linhagem celular de osteossarcoma humano notavelmente versátil que contribuiu para avanços fundamentais na pesquisa de neoplasias ósseas, na biologia do reparo do DNA, na ciência do ritmo circadiano, na farmacologia da endocitose e na análise ômica em larga escala. Seu perfil de TP53 do tipo selvagem, morfologia epitelial aderente, tempo de duplicação rápido e caracterização multi-ômica aprofundada tornam-na um modelo experimental excepcionalmente bem fundamentado. Desde os primeiros estudos de tipagem de HLA até as triagens funcionais contemporâneas baseadas em CRISPR e o perfil de medicamentos por meio do Cell Painting, a U2OS tem se adaptado continuamente às necessidades da comunidade de pesquisa biomédica. Pesquisadores que buscam um modelo confiável e amplamente documentado para a biologia do osteossarcoma, regulação do ciclo celular, resposta a danos no DNA ou triagem de compostos em alto rendimento encontrarão no U2OS uma ferramenta indispensável. Explore as especificações completas ou encomende células U2OS diretamente em cytion.com.

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