Einleitung

Die U2OS-Zellen Die Zelllinie – auch bekannt als U-2 OS, U-2OS, U-2-OS, U2-OS, U20-S, U20S und 2T – ist eine der frühesten etablierten menschlichen Krebszelllinien, die bis heute aktiv genutzt wird. Die Zelllinie wurde Mitte der 1960er Jahre aus einem mäßig differenzierten Osteosarkom der Tibia gewonnen und erstmals 1967 von Pontén und Saksela beschrieben. [1]. Ihre Etablierung bot Forschern ein gut handhabbares, adhärentes Modell mit epithelialer Morphologie zur Untersuchung von Knochenneoplasmen, der Tumorbiologie und der grundlegenden Zellbiologie. In den folgenden Jahrzehnten entwickelte sich U2OS zu einem Eckpfeiler der DNA-Reparaturforschung, der Wirkstoffforschung bei Osteosarkomen, der Zellzyklusanalyse und der Genomprofilierung. Die Zelllinie bewahrt die Wildtyp-Funktion von TP53 – eine relative Seltenheit unter Osteosarkom-Zelllinien –, was sie besonders wertvoll für die Untersuchung von p53-abhängigen Signalwegen, Reaktionen auf DNA-Schäden und der Regulation des zirkadianen Rhythmus macht. Mit einer umfangreichen Sammlung von Omics-Datensätzen und Hunderten veröffentlichter Studien bleibt U2OS eines der meistzitierten und am besten charakterisierten menschlichen Krebsmodelle, die biomedizinischen Wissenschaftlern zur Verfügung stehen.

Die wichtigsten Erkenntnisse

• U2OS (Cellosaurus-Zugangsnummer CVCL_0042) ist eine menschliche Osteosarkom-Zelllinie, die Mitte der 1960er Jahre aus Tibia-Knochengewebe etabliert und 1967 erstmals beschrieben wurde.
• Die Zelllinie trägt das Wildtyp-TP53-Gen und ist daher ein bevorzugtes Modell für Untersuchungen zum p53-abhängigen Zellzyklus und zu DNA-Schäden.
• U2OS-Zellen wachsen als adhärente Monoschichten mit epithelialer Morphologie, wobei die Verdopplungszeit laut Literaturangaben zwischen etwa 25–30 Stunden (DSMZ ACC-785) und 36 Stunden (Mohseny et al.) liegt.
• Die Zelllinie wurde umfassend anhand von Datensätzen aus den Bereichen Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Wirkstoffscreening untersucht, darunter auch die „Cancer Cell Line Encyclopedia“.
• U2OS diente als Plattform für Hunderte von abgeleiteten, gentechnisch veränderten Zelllinien, die in GPCR-Assays, Fluoreszenz-Reporter-Studien und CRISPR-basierten Funktionsscreenings zum Einsatz kamen.
• Die aktuellen Forschungsanwendungen umfassen die Entwicklung von Medikamenten gegen Osteosarkome, DNA-Reparaturmechanismen, zirkadiane Biologie, Endozytose und metabolische Reprogrammierung.

Was ist U2OS?

U2OS wurde aus dem Schienbein einer 15-jährigen Patientin mit Osteosarkom gewonnen. Die Zelllinie wurde Mitte der 1960er Jahre etabliert und erstmals 1967 von Pontén und Saksela beschrieben. [1], und wurde anschließend in die Sammlung menschlicher Tumorzelllinien für die Krebsforschung aufgenommen [2]. Eine frühzeitige immunologische Charakterisierung bestätigte das Fehlen einer Kontamination mit HeLa-Zellen [3] und ermittelte das HLA-Antigenprofil der Zelllinie [4] [5]. Die Zelllinie wächst als adhärente Monoschicht mit epithelialer Morphologie. Die angegebenen Verdopplungszeiten variieren je nach Quelle: laut Eintrag im DSMZ-Katalog (ACC-785) etwa 25–30 Stunden und laut der funktionellen Charakterisierung von Mohseny et al. etwa 36 Stunden. [13] [61]. Sie wird als mäßig differenzierte Osteosarkom-Zelllinie klassifiziert, die das Wildtyp-TP53 beibehält, was sie von anderen Osteosarkom-Zelllinien wie Saos-2 unterscheidet, bei denen die p53-Expression vollständig fehlt. Eine vergleichende Charakterisierung ergab, dass U2OS-Zellen für die meisten klassischen osteoblastischen Marker negativ sind, was ihren im Vergleich zu reiferen Osteosarkom-Zelllinien relativ undifferenzierten Zustand widerspiegelt. [6]. Die Linie ist mikrosatellitenstabil (MSS) und trägt eine heterozygote, trunziierende PPM1D-Variante (p.Arg458Ter, c.1372C>T), die für U2OS in Cellosaurus und DepMap (ACH-000364) erfasst ist. [61]. Die funktionelle Auswirkung dieser Klasse von C-terminal verkürzten PPM1D-Allelen mit Funktionsgewinn – eine Beeinträchtigung des p53-abhängigen G1-Checkpoints – wurde von Kleiblova et al. charakterisiert. [7].

Die Chromosomenanalyse mittels vergleichender genomischer Hybridisierung ergab komplexe genomische Aberrationen in verschiedenen Osteosarkom-Zelllinien, darunter U2OS, mit durchschnittlich 20,8 Aberrationen pro Zelllinie (Bereich 10–31). [8]. Mithilfe der hochauflösenden Array-CGH konnten zudem kryptische Mikroaberrationen identifiziert werden, wobei U-2 OS unter den vier untersuchten Osteosarkom-Zelllinien die geringste Anzahl solcher Ereignisse aufwies – sechs, die niedrigste Inzidenz im Panel –, was mit seinem Wildtyp-TP53-Hintergrund übereinstimmt, während die TP53-mutierte SAOS-2-Zelllinie 17 [9]. Die im Rahmen des EuroBoNeT-Konsortiums durchgeführte molekulare Charakterisierung bestätigte den TP53-Wildtyp-Status für U2OS und identifizierte eine homozygote CDKN2A-Deletion als das mit Abstand häufigste Ereignis im gesamten Knochen-Tumor-Panel (15 von 36 Linien), das eng mit dem Fehlen des p16-Proteins verbunden ist; Für U2OS selbst wurde in Cellosaurus keine CDKN2A-Deletion verzeichnet. [10] [61]. Bei primären osteogenen Sarkomen und verwandten Zelllinien wurden Umlagerungen des p53-Gens nachgewiesen [11], und es wurde gezeigt, dass die Überexpression von Wildtyp-p53 das Zellwachstum in Osteosarkomzellen hemmt [12], was den Wert des U2OS-Modells für die Erforschung des p53-Signalwegs unterstreicht. Funktionsstudien bestätigten, dass U2OS-Zellen nach subkutaner Injektion in vivo Tumore bilden, was ihre Eignung als repräsentatives Osteosarkom-Modell untermauert [13].

Informationen zur Zellkultur

Vorteile von U2OS-Zellen

Einer der bedeutendsten Vorteile von U2OS ist der Erhalt des Wildtyp-TP53. Diese Eigenschaft macht die Zelllinie ideal geeignet für die Untersuchung von p53-abhängigen Prozessen, darunter DNA-Schadens-Checkpoints, Zellzyklusstillstand, Apoptose und transkriptionelle Reaktionen auf genotoxischen Stress. Da viele Osteosarkom- und Krebszelllinien p53-Mutationen aufweisen, füllt U2OS eine wichtige Nische als Knochentumormodell aus, in dem die Pharmakologie des p53-Signalwegs ohne den störenden Einfluss von Funktionsverlustmutationen untersucht werden kann. MDM2-Antagonisten veranschaulichen, warum dieser Unterschied von Bedeutung ist. In einer Reihe von Sarkomzelllinien stabilisierte der MDM2-Antagonist Nutlin-3A p53 und induzierte effizient die nachgeschaltete p53-abhängige Transkription und Apoptose in Linien mit amplifiziertem MDM2; in Zelllinien mit Wildtyp-TP53, aber ohne MDM2-Amplifikation – der in U2OS vorliegende Konfiguration – wurde zwar eine gewisse Reaktion auf Nutlin beobachtet, es kam jedoch nicht zur Induktion von Apoptose [14]. Ein p53-kompetentes Knochentumormodell ermöglicht es daher, den Einfluss des p53-Status und der MDM2-Dosierung getrennt voneinander zu untersuchen, anstatt sie miteinander zu verwechseln.

U2OS-Zellen eignen sich aufgrund ihrer flachen, adhärenten Epithelmorphologie und ihrer relativ großen Zellkerne besonders gut für die Lebendzellmikroskopie und Fluoreszenz-Reporter-Assays. Diese Eigenschaften haben zur Entwicklung von Hunderten gentechnisch veränderter Derivatlinien geführt – darunter U2OS-CRISPR-NUP96-SNAP-Zellen sowie zahlreiche Varianten von PathHunter und LanthaScreen, die alle als Untereinträge von CVCL_0042 katalogisiert sind [61] — die die Transfektierbarkeit und optische Klarheit der Elternlinie nutzen. Die Zelllinie ist zudem Teil mehrerer bedeutender Initiativen zur Erstellung genomischer und proteomischer Profile, darunter das „Cancer Dependency Map“-Projekt (DepMap ACH-000364, das die „Cancer Cell Line Encyclopedia“ einbezieht) und das Zellatlas-Panel des „Human Protein Atlas“, wodurch Forschern umfangreiche Hintergrunddatensätze zur Verfügung stehen, an denen sich experimentelle Ergebnisse messen lassen. [15] [16] [61].

Die Zelllinie hat sich als äußerst gut für genetische Manipulationen geeignet erwiesen und unterstützt sowohl stabile als auch transiente Transfektion, CRISPR-Cas9-Geneditierung, RNAi-Knockdown und virale Transduktion. Dank der effizienten Integration exogener Konstrukte und der robusten Wachstumskinetik ist sie ein praktisches Arbeitspferd für Hochdurchsatz-Screening-Plattformen. Die „Cell Painting“-Profile für 5.259 Wirkstoffe in U2OS bilden einen der größten morphologischen Referenzdatensätze in der chemischen Biologie und wurden mit thermischer Proteomprofilierung kombiniert, um die Wirkmechanismen der Verbindungen in großem Maßstab abzuleiten. [17]. Diese breite Anwendbarkeit – die von der Biologie von Knochenkrebs über die grundlegende Zellbiologie bis hin zur Wirkstoffforschung reicht – ist der Grund für die anhaltende Beliebtheit von U2OS.

Einschränkungen von U2OS-Zellen

Trotz seiner vielen Stärken weist U2OS eine chromosomale Komplexität auf, die die Interpretation erschweren kann. Eine vergleichende genomische Hybridisierung an acht Osteosarkom-Zelllinien ergab durchschnittlich 20,8 chromosomale Aberrationen pro Linie, wobei U2OS in mehreren Regionen Chromosomengewinne und -verluste aufwies. [8]. Die heterozygote, funktionssteigernde Trunkierungsvariante von PPM1D (p.Arg458Ter) beeinträchtigt den p53-abhängigen G1-Checkpoint, was bedeutet, dass p53 zwar auf Sequenzebene vorhanden und vom Wildtyp ist, seine nachgeschaltete Signalübertragung jedoch teilweise abgeschwächt ist [7] [61]. Forscher, die sich mit der präzisen Pharmakologie des p53-Signalwegs befassen, sollten diesen Modifikator bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigen.

Als mäßig differenzierte Osteosarkom-Zelllinie spiegelt U2OS den reifen osteoblastischen Phänotyp nicht originalgetreu wider. Die immunzytochemische Charakterisierung ergab, dass sie für die meisten osteoblastischen Marker negativ ist, im Gegensatz zu den reiferen SaOS-2-Zellen Zeile [6]. In Studien, in denen zuverlässige Marker für die osteogene Differenzierung oder Mineralisierungsreaktionen benötigt werden, könnte sich U2OS daher als weniger repräsentativ für die Biologie von Osteoblasten im Spätstadium erweisen. Darüber hinaus hat U2OS, wie alle etablierten Zelllinien, ex vivo Anpassungen entwickelt, die die Biologie des Primärtumors möglicherweise nicht originalgetreu widerspiegeln, insbesondere hinsichtlich der Wechselwirkungen mit dem Stroma und der dreidimensionalen Architektur [13].

Die langfristige Passagierung von U2OS birgt, wie bei jeder Zelllinie, das Risiko einer genetischen Drift und phänotypischer Abweichungen zwischen den Subklonen. Eine Authentifizierung mittels STRP-Profiling wird dringend empfohlen, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicherzustellen. [18]. Forscher sollten außerdem beachten, dass U2OS nur eine Teilmenge der klassischen extrazellulären Matrixproteine der Osteoblasten exprimiert, was seine Verwendung als Ersatz für Untersuchungen der Knochenmikroumgebung einschränkt, die auf Kollagen I oder andere Produkte reifer Osteoblasten basieren.

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Anwendungsbereiche

Wirkstoffforschung und therapeutisches Screening bei Osteosarkomen

U2OS ist ein primäres Modell für die Bewertung neuartiger und umgewidmeter Wirkstoffe gegen Osteosarkome. In Studien wurden die antitumoralen Wirkungen verschiedener natürlicher und synthetischer Wirkstoffe an dieser Zelllinie untersucht. Curcin C, ein Typ-I-Ribosomen-inaktivierendes Protein aus nach der Keimung gewonnenen Jatropha-curcas-Samen, hemmte nachweislich die Proliferation von U2OS-Zellen durch ROS-vermittelte Apoptose, Autophagie sowie einen Stillstand sowohl in der S- als auch in der G2/M-Phase, wobei dieser Effekt auf die Aktivierung des JNK-Signalwegs bei gleichzeitiger Hemmung des ERK-Signalwegs zurückgeführt wurde; der ROS-Fänger NAC und der JNK-Inhibitor SP600125 schwächten die Reaktion jeweils ab, was die vorgeschlagene Kaskade untermauerte [53]. Eine Folgestudie zeigte, dass die im Vergleich zu Curcin höhere Wirksamkeit von Curcin C in U2OS-Zellen weitgehend durch die LRP1-vermittelte, Clathrin-abhängige Endozytose erklärt wird, die für Curcin C, nicht jedoch für Curcin verfügbar ist.

Aloperin, ein alkaloidhaltiges Naturprodukt, unterdrückte die Proliferation und Klonogenität sowohl von MG-63- als auch von U2OS-Osteosarkomzellen, induzierte Apoptose – was durch Durchflusszytometrie bestätigt wurde – und hemmte die Invasion in Scratch- und Transwell-Assays, verbunden mit einer Herunterregulierung von MMP-2, MMP-9, PI3K und p-AKT1 [54]. Diese Studie hob mehrere konvergierende Signalwege hervor, über die natürliche Alkaloide gleichzeitig das Wachstum und das Metastasierungspotenzial beeinträchtigen könnten. Unabhängig davon wurde gezeigt, dass der natürliche Süßstoffmetabolit Steviol die Proliferation von U2OS dosis- und zeitabhängig hemmt; mechanistische Untersuchungen ergaben einen Zellzyklusstillstand in der G1-Phase sowie einen mitochondrialen Apoptoseweg, der durch ein erhöhtes Bax/Bcl-2-Verhältnis angezeigt wurde [55] – Erkenntnisse, die natürliche Metaboliten als Kandidaten für die Forschung zur Chemoprävention von Osteosarkomen positionieren.

Gerbsäure verstärkte die zytotoxische Wirkung von Cisplatin in U2OS-Zellen, doch erwies sich die Wechselwirkung als stark verhältnisabhängig: Eine Synergie wurde bei Tanninsäure-zu-Cisplatin-Verhältnissen von 90:10 und 85:15 beobachtet, während Verhältnisse von 75:25 und 50:50 antagonistisch wirkten und Tanninsäure allein normale hFOB 1.19-Osteoblasten nicht signifikant hemmte [56]. Jede auf Polyphenolen basierende Sensibilisierungsstrategie hängt daher von einer sorgfältigen Optimierung des Dosierungsverhältnisses ab und nicht von einer einfachen gleichzeitigen Verabreichung. Gallussäure potenzierte in ähnlicher Weise den durch Olaparib induzierten Zelltod und schwächte die erworbene Olaparib-Resistenz in U2OS-Zellen und einem Olaparib-resistenten Derivat (U2OS-PIR) ab, indem sie die Angiogenese hemmte und cPARP, Bcl-2 und Bax modulierte [57], wodurch das Repertoire an Kombinationen natürlicher Verbindungen, die für die Forschung zur Behandlung von Osteosarkomen in Frage kommen, erweitert wurde. Lenvatinib, ein zugelassener Multi-Kinase-Inhibitor, induzierte nachweislich ferroptose-bezogene Veränderungen in U2OS- und 143B-Zellen über eine p-STAT3/p53/xCT-Achse und deckte damit einen neuartigen Mechanismus auf, durch den dieser Wirkstoff das Fortschreiten des Osteosarkoms über seine kanonische Rolle als Angiogenese-Hemmer hinaus unterdrücken könnte [19]. Eine auf natürlichen Killerzellen basierende Immuntherapie wurde an einer Reihe von Osteosarkom-Zelllinien, darunter U2OS, untersucht, wobei die Expression des NKG2D-Liganden mit der NK-vermittelten Abtötungseffizienz korrelierte und aerosolisiertes Interleukin-2 die organspezifische NK-Zellaktivität in vivo verbesserte [20].

Ein umfassenderes Screening auf Sarkom-Wirkstoffe, das 63 menschliche Zelllinien und über 400 onkologische Wirkstoffe umfasste, dokumentierte die Wirkstoffempfindlichkeitsprofile von U2OS zusammen mit Gen- und microRNA-Expressionsdaten und lieferte damit eine reichhaltige pharmakogenomische Referenz für dieses Forschungsgebiet [21]. Das wegweisende Projekt „Cancer Cell Line Encyclopedia“ integrierte Genexpressions-, Kopienzahl- und Sequenzierungsdaten von fast 950 Zelllinien, darunter U2OS, und korrelierte diese mit Wirkstoffempfindlichkeitsprofilen, um prädiktive Biomarker für das Ansprechen zu identifizieren [15]. Eine nachfolgende pharmakogenomische Landschaftsstudie ordnete Zusammenhänge zwischen Arzneimittelsensitivität und krebsbedingten Veränderungen bei mehr als 1.000 annotierten Zelllinien zu und stellte die Reaktionen von U2OS damit in einen breiteren onkologischen Kontext [22].

Die miR-16-1-3p/MDM2/p53-Achse hat sich als wichtiger Regulator der TGF-β1-Signalübertragung beim Osteosarkom herausgestellt. Xue et al. zeigten, dass die Überexpression von miR-16-1-3p das Proliferations- und Klonbildungspotenzial von U2OS-Zellen deutlich reduzierte, während die Kombination mit einer TGF-β-Behandlung den G1-Phasen-Stillstand stark verstärkte und die Tumorwachstumsfähigkeit nahezu aufhob [23]. Dieselbe Studie zeigte, dass miR-16-1-3p die TGF-β-induzierte Aktin-Umstrukturierung und die mit der epithelial-mesenchymalen Transition verbundenen Veränderungen hemmte, und dass die gleichzeitige Verabreichung die Cisplatin-Empfindlichkeit in Wildtyp-U2OS-Zellen erhöhte sowie das Tumorknotenvolumen und die Metastasierung im Modell der Chorioallantoismembran von Küken reduzierte, was einen mechanistischen Einblick darin lieferte, wie diese Mikro-RNA den pro-metastatischen Zweig der TGF-β-Signalübertragung unterdrückt. Es zeigte sich, dass von Osteoblasten stammende extrazelluläre Vesikel (OB-EVs) das Verhalten von Osteosarkomzellen linienabhängig verändern: In U2OS-Zellen reduzierten sie die Stoffwechselaktivität (um das 1,30-Fache) und die Proliferation (um das 1,70-Fache), während sie die Apoptose (um das 1,15-Fache) erhöhten; in MG-63-Zellen hingegen stieg die Proliferation um das 4,9-Fache an. Die begleitende Transkriptom-Profilierung wurde an MNNG/HOS-Zellen durchgeführt, bei denen 296 Gene differentiell exprimiert waren; die Autoren schlagen den miRNA-Shuttle-Mechanismus als potenziell beteiligten Mechanismus vor, der jedoch noch einer funktionellen Validierung bedarf [24]. Die metabolische Umprogrammierung beim Osteosarkom wurde mittels Einzelzell-Transkriptomik untersucht, wobei Stanniocalcin-2 (STC2) als zentraler Regulator der Glykolyse identifiziert wurde, der in MG-63- und U2OS-Zellen mittels Seahorse-Extrazellulärflussanalyse funktionell validiert wurde [25].

DNA-Reparatur, Zellzyklusregulation und DNA-Schadensantwort

U2OS ist eines der am häufigsten verwendeten Modelle in der DNA-Reparaturforschung, vor allem weil sein Wildtyp-p53-Hintergrund die Untersuchung des gesamten Spektrums p53-abhängiger Schadensreaktionen ermöglicht. Eine genomweite Studie kartierte das zellzyklusregulierte Transkriptom von U2OS und identifizierte 2.140 periodisch exprimierte Transkripte, die 1.871 einzigartigen Genen über mehrere synchrone Zellzyklen hinweg entsprechen [52]. Durch die Kombination von ChIP-seq-Daten für den G2/M-Transkriptionsfaktor FOXM1 mit veröffentlichten ChIP-seq-Daten für E2F1, E2F4, E2F6, GABPA und den DREAM-Komplex zeigten die Autoren, dass FOXM1 die Promotoren von G2/M-Phasen-Genen stark aktiviert, während es die in der S-Phase induzierten Gene nur schwach aktiviert, und dass eine Kerngruppe von Zellzyklusgenen, die U2OS und HeLa gemeinsam haben, von mehreren Zellzyklus-Transkriptionsfaktoren gebunden wird. Der Datensatz etablierte U2OS als zweites, unabhängig charakterisiertes menschliches Modell zur Kartierung des Zellzyklus-Transkriptoms und ist nach wie vor eine weit verbreitete Referenz für Studien zur Genregulation des menschlichen Zellteilungszyklus.

Gain-of-Function-Mutationen in PPM1D/Wip1 – der Phosphatase, die p53 inaktiviert – führen zu einem C-terminal verkürzten, hyperaktiven Wip1 und beeinträchtigen den p53-abhängigen G1-Checkpoint nach einer DNA-Schädigung; U2OS trägt ein solches verkürztes Allel (p.Arg458Ter) heterozygot [7] [61]. Dies macht U2OS zu einem nützlichen Modell, um zu untersuchen, wie Wip1-Verkürzungen durch Abschwächung der DNA-Schadensantwort einen selektiven Wachstumsvorteil verleihen. Die Variabilität der DNA-Schadensantwort auf Einzelzellniveau wurde in U2OS-Zellen quantifiziert, die 2 Gy Photonen ausgesetzt waren; durch den Vergleich von 53BP1- und γH2AX-Foci in Schwesterkernen von zweikernigen Zellen wiesen Płódowska et al. stochastische Zell-zu-Zell-Schwankungen bei der Bildung von Reparaturfoci nach, die sich mit zufällig verteilten DNA-Schäden überlagerten, wobei diese Schwankungen 28 % der Gesamtvariabilität bei 53BP1-Foci und 50 % bei γH2AX-Foci ausmachten [26]. Eine Analyse des Schwesterchromatidenaustauschs in Weichteilsarkom-Zelllinien, einschließlich U2OS-Kontrollzellen, bestätigte, dass die endogene γH2AX-Bildung mit genomischer Instabilität korreliert und das Ansprechen auf DNA-schädigende Behandlungen vorhersagen kann [27].

U2OS-Zellen wurden eingesetzt, um die somatische CAG-Repeat-Expansion bei der Huntington-Krankheit zu untersuchen. Die genetische Disruption der MSH3-Y245/K246-IDL-Bindungsstelle reduzierte die DNA-Interaktion signifikant und unterband die Repeat-Expansion in einer U2OS-Zelllinie, die mutiertes HTT-Exon 1 exprimierte; die pharmakologische Blockade derselben Stelle reduzierte die Repeat-Expansion in U2OS-Zellen und verlangsamte – was besonders wichtig ist – auch die Expansion in mittelstacheligen Neuronen, die aus iPS-Zellen von Huntington-Patienten gewonnen wurden [28]. Die U2OS-DR-GFP-Derivatlinie wurde häufig für Assays zur homologen Rekombinationsreparatur verwendet, und es wurden mehrere Knockout-Derivate – darunter RAD52-, TBK1- und OPTN-Knockouts – erzeugt, um spezifische Komponenten des Reparaturweges zu untersuchen; alle sind als untergeordnete Einträge von CVCL_0042 katalogisiert [61] katalogisiert. Der Tumorsuppressor TSC2 wurde als Stressgranulat-Suppressor identifiziert; in einem Preprint, der über diese Arbeit berichtet, führte eine siRNA-vermittelte teilweise Reduktion von TSC2 in U2OS-Zellen nicht zur Bildung spontaner Stressgranula, im Gegensatz zu dem vollständigen Verlust, der in embryonalen Fibroblasten der Maus beobachtet wurde, wodurch TSC2 als schwellenwertabhängiger Regulator der Stressgranula-Bildung etabliert wurde [29]. Genomweite Screenings auf homozygote Deletionen und Störungen von Genen des Polaritätskomplexes in Krebszelllinien-Panels haben ebenfalls U2OS-Daten einbezogen und so zur Identifizierung rezessiver Krebsgene und Signaturen fragiler Stellen beigetragen [30] [31].

Zirkadiane Biologie und Genregulation

U2OS hat sich zu einem führenden Modell für die Erforschung der zirkadianen Uhr bei Säugetieren entwickelt. Die Zellen weisen robuste, sich selbst erhaltende zirkadiane Rhythmen auf und werden routinemäßig mit Luciferase-Reportern für Uhrgene zur Echtzeit-Luminometrie eingesetzt. Burke et al. zeigten anhand von U2OS-Zellen, die Luciferase-Reporter für Uhrgene exprimieren, dass Koffein die zirkadiane Periode dosisabhängig verlängert, und stellten durch pharmakologische Analyse und siRNA-Knockdown fest, dass die Signalübertragung über Adenosinrezeptoren – und nicht die Aktivität von Ryanodinrezeptoren oder Phosphodiesterasen – für diesen Effekt verantwortlich ist [59]. Dasselbe System ermöglicht ein chemisches Screening in großem Maßstab: Ein Hochdurchsatz-Screening bestehender Medikamente in U2OS-Zellen ergab, dass etwa 5 % die zirkadiane Periode veränderten, wobei Dehydroepiandrosteron als periodenverkürzende Verbindung identifiziert und ABL1, ABL2 sowie die BCR-Kinase in die Periodenregulation einbezogen wurden [60]. Diese Eigenschaften wurden umfassend genutzt, um die molekularen Mechanismen zu charakterisieren, die den zentralen BMAL1/CLOCK-Transkriptions-Translations-Rückkopplungskreis und dessen Wechselwirkungen mit onkogenen Signalwegen steuern.

Ein kürzlich veröffentlichter Preprint untersuchte die endogene zirkadiane Natur von c-MYC in U2OS-Zellen. Durch die Erzeugung eines c-MYC-Reporters und den Vergleich seiner Oszillationsphase mit den BMAL1- und PER2-Reportern berichteten Kalyanaraman et al., dass der c-MYC-Promotor in U2OS-Zellen – einer Zelllinie mit von Natur aus niedrigen MYC-Spiegeln – rhythmisch oszilliert und dabei gegenüber den Kernkomponenten der Uhr phasenverschoben oszilliert [32]. Ein auf diesen Erkenntnissen basierendes Computermodell legte nahe, dass MYC als Störfaktor der Uhr fungiert, dessen zeitlicher Ablauf die negativen Auswirkungen auf die zirkadiane Zeitmessung minimiert – eine Erkenntnis, die für das Verständnis davon von Bedeutung ist, wie die onkogene MYC-Überexpression die zirkadiane Physiologie stört. Da es sich um ein Preprint handelt, hat diese Arbeit das Peer-Review-Verfahren noch nicht durchlaufen. Dennoch veranschaulicht sie die Eignung von U2OS für die gleichzeitige Untersuchung der Onkogenfunktion und der zirkadianen Regulation.

U2OS ist telomerase-negativ und erhält seine Telomere durch alternative Telomerverlängerung (ALT), den auf Rekombination basierenden Mechanismus, der erstmals von Bryan et al. [58] in einer Untergruppe von Tumoren und tumorabgeleiteten Zelllinien dokumentiert wurde. Dies macht sie zu einem Standardmodell für die ALT-Forschung, einem Mechanismus, der bei einer Untergruppe von Krebsarten, darunter Osteosarkome, aktiv ist. Die Zelllinie wird zudem häufig in Studien zur Dynamik von Histonmodifikationen, zur Kernarchitektur und zur Chromatinorganisation eingesetzt, wobei ihre großen Kerne und ihre optische Untersuchbarkeit genutzt werden. Fluoreszenzmarkierte Histon- und Kernporen-Derivate – darunter U2OS EGFP-H2B und mehrere von U2OS abgeleitete, mit CRISPR markierte NUP96-Linien – haben die quantitative Bildgebung von Chromatin- und Kerntransportprozessen mit hoher räumlicher Auflösung ermöglicht [61].

Endozytose und intrazellulärer Transport

U2OS hat sich aufgrund seiner robusten Rezeptor-Internalisierungsaktivität und seiner Eignung für quantitative, fluoreszenzbasierte CME-Assays zur Messung der Transferrin-Alexa594-Aufnahme als Standardmodell für die Untersuchung der Clathrin-vermittelten Endozytose (CME) und der Dynamin-GTPase-Aktivität etabliert. Eine Reihe von Sulfonadyn-Verbindungen – von Dansylcadaverin-Analoga abgeleitete Arylsulfonamide – wurde unter Verwendung von U2OS-Zellen als primäre CME-Assay-Plattform als GTP-kompetitive Dynamin-I- und Dynamin-II-Inhibitoren charakterisiert [33]. Eine Michaelis-Menten-Kinetikanalyse in diesem System bestätigte den Hemmmechanismus, und das wirksamste Analogon zeigte zudem antiepileptische Aktivität in Tiermodellen, wodurch sich U2OS-basierte CME-Assays als translationales Werkzeug für die neurologische Wirkstoffforschung etablierten.

Unabhängig davon wurden das aus Meeresorganismen stammende Hydroxychinon-Sesquiterpen Bolinaquinon und verwandte Naphthochinon-Analoga hinsichtlich ihrer CME-hemmenden Aktivität in U2OS-Zellen untersucht, wobei eine durch die Dichtefunktionaltheorie geleitete Strukturoptimierung zu Analoga führte, deren Wirksamkeit sowohl gegen Dynamin-GTPase als auch gegen CME erheblich verbessert war [34]. Diese Studien veranschaulichen, wie U2OS-basierte CME-Assays als empfindliche und reproduzierbare Plattform für Struktur-Wirkungs-Beziehungsstudien an Endozytosie-Inhibitoren dienen. Die konsistente Rezeptorexpression und die vorhersagbare Internalisationskinetik dieser Zelllinie machen sie zu einem bevorzugten Zellsystem für diese Art von Forschung.

Das Schicksal von Antisense-Oligonukleotiden (ASOs) nach der zellulären Aufnahme wurde in U2OS-Zellen mittels Lebendzellmikroskopie, ratiometrischer pH-Messungen und dreidimensionaler Fokussierter-Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie verfolgt. In einem Preprint, der über diese Arbeit berichtet, zeigten Sitarska et al., dass selbst unter Bedingungen, bei denen die Ziel-RNA um über 90 % reduziert wurde, weniger als 4 % der internalisierten ASOs den Zellkern erreichten und dass sich ASOs in späten Endosomen, Endolysosomen und Lysosomen anreicherten, wo sie eine luminalen Neutralisation induzierten, ohne dass Galectin-3 rekrutiert wurde oder die Begrenzungsmembran aufbrach [35]. Die Autoren vermuten, dass ein produktives Entkommen stattdessen bereits zu einem früheren Zeitpunkt der Endozytose stattfindet, höchstwahrscheinlich in frühen oder Recycling-Endosomen. U2OS-Zellen wurden zudem in einem GLP-1R-Aktivierungstest eingesetzt – einer U2OS-Zelllinie, die cAMP-sensitive Nomad-Biosensoren exprimiert –, um die metabolischen Wirkungen eines in Phospholipiden formulierten Bergamotte-Extrakts zu bewerten, was die Eignung der Linie als gentechnisch veränderte Plattform zur Rezeptorexpression für die Naturstoffpharmakologie demonstrierte [36]. Die Cybrid-Technologie zur Untersuchung von Mutationen der mitochondrialen DNA wurde weiterentwickelt, indem neu entwickelte mtDNA-freie (ρ0) Derivate von HCT116, HT1080 und U2OS als Empfängerzelllinien für die Erzeugung transmitochondrialer Cybride validiert wurden [37].

Proteomik, Genomik und Multi-Omics-Plattformen

U2OS ist eine wichtige Referenzzelllinie in groß angelegten Proteomik-Projekten. Das erste spezifische Proteomprofil von U2OS wurde von Niforou et al. mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese in Verbindung mit MALDI-Massenspektrometrie erstellt: Etwa 3.000 Spots wurden aus zwei 2-DE-Gelen herausgeschnitten und analysiert, was zur Identifizierung von 237 verschiedenen Genprodukten führte, darunter 11 Protoonkogene, die mit dem Krebszustand der Linie in Zusammenhang stehen [16]. In nachfolgenden massenspektrometrischen Untersuchungen wurde das absolute Proteom dieser Zelllinie in der Interphase und Mitose quantifiziert – in der Veröffentlichung als häufig verwendete menschliche Zelllinie beschrieben und in Cellosaurus der U2OS-Zelllinie zugeordnet –, wobei die Expression von mindestens etwa 10.000 Proteinen nachgewiesen wurde, deren zelluläre Häufigkeit sich über sieben Größenordnungen erstreckte, bis zu 20 Millionen Kopien pro Zelle [38] [61]. Vergleichende Proteomik an elf gängigen Zelllinien zeigte, dass U2OS einen Kern ubiquitär exprimierter Proteine teilt, während sie zelltypspezifische Variationen in funktionellen Untergruppen aufweist [39].

Im Rahmen einer groß angelegten Zelloberflächen-Proteomik unter Verwendung der Cell-Surface-Capture-Technologie wurde das Oberflächenom von U2OS zusammen mit 40 anderen menschlichen Zelltypen (insgesamt 41 menschliche und 31 Mauszelltypen) katalogisiert, wodurch eine Ressource zur Identifizierung pharmakologisch zugänglicher Oberflächenziele geschaffen wurde [40]. Studien zur HLA-Typisierung und zur Vorhersage von Neoepitopen bezogen U2OS ein, um die Entwicklung von Zielmolekülen für die Krebsimmuntherapie zu unterstützen [41] [42]. Die Charakterisierung mittels Reverse-Phase-Protein-Array von über 650 Krebszelllinien umfasste auch U2OS und zeigte, dass phosphoproteomische Daten eine Vorhersagekraft hinsichtlich der Arzneimittelsensitivität bieten, die über die allein durch mRNA-Messungen verfügbaren Informationen hinausgeht [43]. Die krebsartenübergreifende Proteomkarte, die 949 Zelllinien abdeckt, integrierte die Proteomdaten von U2OS zusätzlich mit CRISPR-Essentialitäts-Screenings und Daten zum Ansprechen auf Medikamente und deckte so Tausende von Proteinbiomarkern für die Anfälligkeit von Krebs auf [44].

Die transkriptomweite Charakterisierung von 675 Krebszelllinien mittels RNA-Sequenzierung katalogisierte Genfusionen, Mutationssignaturen und die Expression nicht-menschlicher Sequenzen in U2OS [45]. Die CCLE-Charakterisierung der nächsten Generation erweiterte die Profilierung um Daten zur DNA-Methylierung, Histonmodifikation, microRNA-Expression und RNA-Spleißung über 1.072 Linien hinweg, wobei U2OS zu integrativen Analysen der molekularen Merkmale beitrug, die dem Ansprechen auf Medikamente zugrunde liegen [46]. Die quantitative Proteomik des CCLE-Panels identifizierte eine Dysregulation von Signalwegen auf Proteinebene, die aus genomischen oder transkriptomischen Daten allein nicht ersichtlich war [47]. Die Kombination von „Cell Painting“ mit „Thermal Proteome Profiling“ in U2OS-Zellen erwies sich als leistungsstarke Strategie zur Ableitung von Wirkmechanismen von Medikamenten durch die Integration morphologischer Profilierung mit der unverzerrten Erkennung von Protein-Targets [17]. Die proteomischen Datensätze von U2OS unterliegen zudem einer Qualitätskontrolle auf Virom-Ebene: Als allgemeiner Screening-Schritt wurde ein Xeno-Proteomik-Workflow für den zielunabhängigen Nachweis viraler Proteine in proteomischen Daten entwickelt, wobei die Autoren empfehlen, jeden zellulären Proteom-Datensatz vor der Veröffentlichung auf nicht-menschliche Proteine zu überprüfen [48]. Eine integrative epigenomische Analyse des Osteosarkoms unter Einbeziehung von U2OS-Zellen identifizierte 350 Gene mit übereinstimmenden genetischen und epigenetischen Abweichungen und trug so zum besseren Verständnis der regulatorischen Landschaft bei, die das Fortschreiten von Knochentumoren steuert [49]. Die Proteinexpression in Zell-Microarrays wurde zudem unter Verwendung von in Agarose-Matrizen eingebetteten U2OS-Zellen bewertet, was die gleichzeitige Profilierung mehrerer Zelllinien im Gewebe-Microarray-Format ermöglichte [50]. Frühe Markerreaktionen von U2OS-Zellen auf Extrakte eines mit Hyaluronsäure beschichteten xenogenen Knochentransplantats wurden mittels qRT-PCR charakterisiert: RUNX2 war um das 2,61-Fache hochreguliert (p = 0,01), während für COL1A1 kein signifikanter Effekt berichtet wurde und die beobachteten Unterschiede in der Stoffwechselaktivität nach FDR-Korrektur nicht signifikant blieben [51]. Die Autoren bezeichnen die Studie als explorativ und fordern eine Validierung an Primärzellen und in In-vivo-Modellen.

Schlussfolgerung

U2OS (CVCL_0042) ist eine bemerkenswert vielseitige menschliche Osteosarkom-Zelllinie, die zu grundlegenden Fortschritten in der Forschung zu Knochenneoplasmen, der DNA-Reparaturbiologie, der Circadianrhythmusforschung, der Endozytose-Pharmakologie und der groß angelegten Omics-Profilierung beigetragen hat. Ihr Wildtyp-TP53-Hintergrund, ihre adhärente Epithelmorphologie, ihre schnelle Verdopplungszeit und ihre umfassende Multi-Omics-Charakterisierung machen sie zu einem außergewöhnlich gut abgestützten experimentellen Modell. Von frühen HLA-Typisierungsstudien bis hin zu zeitgenössischen CRISPR-basierten Funktionsscreenings und dem „Cell Painting“-Wirkstoffprofiling hat sich U2OS kontinuierlich an die Bedürfnisse der biomedizinischen Forschungsgemeinschaft angepasst. Forscher, die ein zuverlässiges, umfassend dokumentiertes Modell für die Osteosarkom-Biologie, die Zellzyklusregulation, die DNA-Schadensantwort oder das Hochdurchsatz-Screening von Wirkstoffen suchen, werden U2OS als unverzichtbares Werkzeug schätzen. Entdecken Sie die vollständigen Spezifikationen oder bestellen Sie U2OS-Zellen direkt unter cytion.com.

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