Introduzione

Il Cellule U2OS La linea cellulare — nota anche come U-2 OS, U-2OS, U-2-OS, U2-OS, U20-S, U20S e 2T — è una delle prime linee cellulari tumorali umane isolate e ancora oggi attivamente utilizzate. La linea è stata ottenuta a metà degli anni ’60 da un osteosarcoma moderatamente differenziato della tibia ed è stata descritta per la prima volta da Pontén e Saksela nel 1967 [1]. La sua creazione ha fornito ai ricercatori un modello maneggevole, aderente e con morfologia epiteliale per lo studio delle neoplasie ossee, della biologia tumorale e della biologia cellulare fondamentale. Nei decenni successivi, la linea cellulare U2OS è diventata una pietra miliare della ricerca sulla riparazione del DNA, della scoperta di farmaci per l’osteosarcoma, dell’analisi del ciclo cellulare e della profilazione genomica. La linea cellulare conserva la funzione del gene TP53 di tipo selvatico — una rarità relativa tra le linee di osteosarcoma — rendendola particolarmente preziosa per lo studio delle vie p53-dipendenti, delle risposte al danno al DNA e della regolazione del ritmo circadiano. Grazie a una vasta raccolta di set di dati omici e a centinaia di studi pubblicati, la linea U2OS rimane uno dei modelli di cancro umano più citati e meglio caratterizzati a disposizione degli scienziati biomedici.

Punti chiave

• U2OS (numero di accesso Cellosaurus CVCL_0042) è una linea cellulare di osteosarcoma umano ottenuta a metà degli anni '60 da tessuto osseo tibiale e descritta per la prima volta nel 1967.
• Questa linea è portatrice del gene TP53 di tipo selvatico, il che la rende un modello privilegiato per gli studi sul ciclo cellulare p53-dipendente e sul danno al DNA.
• Le cellule U2OS crescono sotto forma di monostrati aderenti con morfologia epiteliale, con un tempo di raddoppio riportato compreso tra circa 25–30 ore (DSMZ ACC-785) e 36 ore (Mohseny et al.).
• La linea è ampiamente documentata in set di dati relativi alla genomica, alla trascrittomica, alla proteomica e allo screening farmacologico, compresa la Cancer Cell Line Encyclopedia.
• U2OS ha fatto da piattaforma per centinaia di linee cellulari ingegnerizzate derivate, utilizzate in saggi sui GPCR, studi con reporter fluorescenti e screening funzionali basati su CRISPR.
• Le attuali applicazioni della ricerca spaziano dalla scoperta di farmaci per l'osteosarcoma ai meccanismi di riparazione del DNA, alla biologia circadiana, all'endocitosi e alla riprogrammazione metabolica.

Che cos’è U2OS?

La linea cellulare U2OS è stata isolata dall'osso tibiale di una paziente di 15 anni affetta da osteosarcoma. La linea è stata creata a metà degli anni '60 e descritta per la prima volta da Pontén e Saksela nel 1967 [1], ed è stata successivamente inserita nel catalogo delle linee tumorali umane destinate alla ricerca sul cancro [2]. Una prima caratterizzazione immunologica ha confermato l'assenza di contaminazione da cellule HeLa [3] e ha determinato il profilo degli antigeni HLA della linea cellulare [4] [5]. La linea cresce sotto forma di monostrato aderente con morfologia epiteliale. I tempi di raddoppio riportati variano a seconda della fonte: circa 25–30 ore secondo la scheda del catalogo DSMZ (ACC-785) e circa 36 ore nella caratterizzazione funzionale di Mohseny et al. [13] [61]. È classificata come una linea di osteosarcoma moderatamente differenziata che conserva il gene TP53 in forma wild-type, il che la distingue da altre linee di osteosarcoma come la Saos-2, che è completamente priva di espressione di p53. La caratterizzazione comparativa ha dimostrato che le cellule U2OS risultano negative alla maggior parte dei marcatori osteoblastici classici, il che riflette il loro stato relativamente indifferenziato rispetto alle linee di osteosarcoma più mature [6]. La linea è stabile dal punto di vista dei microsatelliti (MSS) e presenta una variante troncante eterozigote del gene PPM1D (p.Arg458Ter, c.1372C>T), registrata per la linea U2OS nelle banche dati Cellosaurus e DepMap (ACH-000364) [61]. La conseguenza funzionale di questa classe di alleli PPM1D con troncamento C-terminale e guadagno di funzione — ovvero la compromissione del checkpoint G1 dipendente da p53 — è stata descritta da Kleiblova et al. [7].

L'analisi cromosomica mediante ibridazione genomica comparativa ha rivelato la presenza di aberrazioni genomiche complesse nelle linee cellulari di osteosarcoma, tra cui la linea U2OS, con una media di 20,8 aberrazioni per linea (intervallo 10–31) [8]. L’analisi CGH ad alta risoluzione ha inoltre identificato microaberrazioni criptiche, e la linea U-2 OS ha mostrato il minor numero di tali eventi tra le quattro linee di osteosarcoma esaminate — sei, l’incidenza più bassa del gruppo — in linea con il suo background TP53 wild-type, mentre la linea SAOS-2 con TP53 mutante ne presentava 17 [9]. La caratterizzazione molecolare condotta nell’ambito del consorzio EuroBoNeT ha confermato lo stato wild-type del gene TP53 per la linea U2OS e ha identificato la delezione omozigote del gene CDKN2A come l’evento più comune nell’intero panel dei tumori ossei (15 su 36 linee), strettamente associato all’assenza della proteina p16; non è stata registrata alcuna delezione di CDKN2A per la linea U2OS stessa in Cellosaurus [10] [61]. Sono state documentate riorganizzazioni del gene p53 nei sarcomi osteogenici primari e nelle linee cellulari correlate [11], ed è stato dimostrato che la sovraespressione della proteina p53 di tipo selvatico blocca la crescita delle cellule di osteosarcoma [12], sottolineando il valore del modello U2OS per la ricerca sulla via di segnalazione di p53. Studi funzionali hanno confermato che le cellule U2OS formano tumori in vivo dopo l’iniezione sottocutanea, confermando la loro utilità come modello rappresentativo dell’osteosarcoma [13].

Informazioni sulla coltura cellulare

Vantaggi delle celle U2OS

Uno dei vantaggi più significativi della linea U2OS è il mantenimento del gene TP53 in forma wild-type. Questa proprietà rende la linea particolarmente adatta allo studio dei processi dipendenti da p53, tra cui i checkpoint del danno al DNA, l’arresto del ciclo cellulare, l’apoptosi e le risposte trascrizionali allo stress genotossico. Poiché molte linee cellulari di osteosarcoma e di tumori presentano mutazioni di p53, la linea U2OS ricopre un ruolo fondamentale come modello di tumore osseo in cui è possibile valutare la farmacologia della via di p53 senza l’effetto confondente delle mutazioni con perdita di funzione. Gli antagonisti di MDM2 illustrano perché questa distinzione sia importante. In un panel di linee cellulari di sarcoma, l’antagonista di MDM2 Nutlin-3A ha stabilizzato p53 e ha indotto in modo efficiente la trascrizione a valle dipendente da p53 e l’apoptosi nelle linee che presentavano un’amplificazione di MDM2; nelle linee con TP53 wild-type ma senza amplificazione di MDM2 — la configurazione riscontrata in U2OS — è stata osservata una certa risposta a Nutlin, ma l’apoptosi non è stata indotta [14]. Un modello di tumore osseo in cui la funzione di p53 è intatta consente quindi di analizzare separatamente il contributo dello stato di p53 e del dosaggio di MDM2, anziché confonderli.

Le cellule U2OS sono particolarmente adatte alla microscopia su cellule vive e ai test con marcatori fluorescenti grazie alla loro morfologia epiteliale piatta e aderente e alle dimensioni relativamente grandi del nucleo. Queste proprietà hanno portato alla creazione di centinaia di linee derivate ingegnerizzate, tra cui Cellule U2OS-CRISPR-NUP96-SNAP e numerose varianti di PathHunter e LanthaScreen, tutte catalogate come voci secondarie di CVCL_0042 [61] — che sfruttano la trasfettabilità e la trasparenza ottica della linea parentale. La linea cellulare fa inoltre parte di numerose importanti iniziative di profilazione genomica e proteomica, tra cui il progetto Cancer Dependency Map (DepMap ACH-000364, che integra la Cancer Cell Line Encyclopedia) e il panel dell’atlante cellulare Human Protein Atlas, fornendo ai ricercatori ricchi set di dati di riferimento con cui confrontare i risultati sperimentali [15] [16] [61].

Questa linea si è dimostrata altamente suscettibile alla manipolazione genetica, consentendo trasfezione stabile e transitoria, editing genetico con CRISPR-Cas9, knockdown tramite RNAi e trasduzione virale. La sua efficiente integrazione di costrutti esogeni e le robuste cinetiche di crescita la rendono uno strumento pratico e affidabile per le piattaforme di screening ad alta produttività. I profili di «Cell Painting» relativi a 5.259 farmaci nelle cellule U2OS costituiscono uno dei più vasti set di dati morfologici di riferimento nel campo della biologia chimica e sono stati combinati con la profilazione proteomica termica per dedurre il meccanismo d’azione dei composti su larga scala [17]. Questa ampia gamma di applicazioni — che spazia dalla biologia del cancro osseo alla biologia cellulare fondamentale, fino alla scoperta di nuovi farmaci — è alla base della popolarità duratura della linea cellulare U2OS.

Limiti delle cellule U2OS

Nonostante i suoi numerosi punti di forza, la linea U2OS presenta una complessità cromosomica che può complicarne l’interpretazione. L’ibridazione genomica comparativa condotta su otto linee di osteosarcoma ha rivelato una media di 20,8 aberrazioni cromosomiche per linea, con la linea U2OS che mostrava guadagni e perdite in diverse regioni [8]. La variante troncante eterozigote con guadagno di funzione del gene PPM1D (p.Arg458Ter) compromette il checkpoint G1 dipendente da p53; ciò significa che, sebbene p53 sia presente e di tipo selvatico a livello di sequenza, la sua segnalazione a valle risulta parzialmente attenuata [7] [61]. I ricercatori che si occupano della farmacologia specifica della via di segnalazione p53 dovrebbero tenere conto di questo fattore modificante nell'interpretazione dei risultati.

Essendo una linea cellulare di osteosarcoma moderatamente differenziata, la linea U2OS non riproduce fedelmente il fenotipo osteoblastico maturo. La caratterizzazione immunocitochimica ha evidenziato che risulta negativa alla maggior parte dei marcatori osteoblastici, a differenza delle linee più mature Cellule SaOS-2 riga [6]. Gli studi che richiedono marcatori affidabili della differenziazione osteogenica o delle risposte di mineralizzazione potrebbero quindi ritenere che la linea cellulare U2OS sia meno rappresentativa della biologia degli osteoblasti nelle fasi avanzate. Inoltre, come tutte le linee cellulari consolidate, la U2OS ha sviluppato adattamenti ex vivo che potrebbero non riflettere fedelmente la biologia del tumore primario, in particolare per quanto riguarda le interazioni con lo stroma e l’architettura tridimensionale [13].

Il passaggio a lungo termine delle cellule U2OS, come per qualsiasi linea cellulare, comporta il rischio di deriva genetica e di variazioni fenotipiche tra i sottocloni. Si raccomanda vivamente di effettuare l’autenticazione tramite profilazione delle ripetizioni in tandem corte (STR) per garantire la riproducibilità tra i laboratori. [18]. I ricercatori dovrebbero inoltre tenere presente che la linea cellulare U2OS esprime solo un sottoinsieme delle proteine classiche della matrice extracellulare osteoblastica, il che ne limita l’utilizzo come indicatore sostitutivo negli studi sul microambiente osseo che si basano sul collagene I o su altri prodotti degli osteoblasti maturi.

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Applicazioni

Ricerca di farmaci e screening terapeutico per l'osteosarcoma

La linea cellulare U2OS è uno strumento fondamentale per la valutazione di composti nuovi e riproposti contro l’osteosarcoma. Diversi studi hanno esaminato le attività antitumorali di vari agenti naturali e sintetici su questa linea cellulare. È stato dimostrato che la curcina C, una proteina inattivante i ribosomi di tipo I proveniente da semi di Jatropha curcas post-germinati, ha dimostrato di inibire la proliferazione delle cellule U2OS attraverso l’apoptosi mediata dai ROS, l’autofagia e l’arresto sia nella fase S che nella fase G2/M; tale effetto è stato attribuito all’attivazione della via di segnalazione JNK insieme all’inibizione della via ERK; sia lo scavenger di ROS NAC che l’inibitore di JNK SP600125 hanno attenuato la risposta, a conferma della cascata proposta [53]. Uno studio di follow-up ha dimostrato che la maggiore potenza della Curcina C rispetto alla Curcina nelle cellule U2OS è spiegata in gran parte dall’endocitosi clatrina-dipendente mediata da LRP1, alla quale la Curcina C ha accesso mentre la Curcina no.

L’aloperina, un alcaloide di origine naturale, ha soppresso la proliferazione e la clonogenicità delle cellule di osteosarcoma sia MG-63 che U2OS, ha indotto l’apoptosi, come confermato dalla citometria a flusso, e ha inibito l’invasione nei test scratch e transwell, con una downregulation di MMP-2, MMP-9, PI3K e p-AKT1 [54]. Questo studio ha evidenziato molteplici vie convergenti attraverso le quali gli alcaloidi naturali potrebbero compromettere contemporaneamente la crescita e il potenziale metastatico. Indipendentemente da ciò, è stato dimostrato che lo steviolo, un metabolita dolcificante naturale, inibisce la proliferazione delle cellule U2OS in modo dose- e tempo-dipendente; un’analisi meccanicistica ha rivelato un arresto del ciclo cellulare in fase G1 e una via apoptotica mitocondriale indicata da un aumento del rapporto Bax/Bcl-2 [55] — risultati che indicano i metaboliti naturali come candidati per la ricerca sulla chemioprevenzione dell’osteosarcoma.

L’acido tannico ha potenziato l’effetto citotossico del cisplatino nelle cellule U2OS, ma l’interazione si è rivelata fortemente dipendente dal rapporto: si è osservata sinergia con rapporti tra acido tannico e cisplatino pari a 90:10 e 85:15, mentre rapporti di 75:25 e 50:50 hanno mostrato un effetto antagonistico; inoltre, l’acido tannico da solo non ha inibito in modo significativo gli osteoblasti normali hFOB 1.19 [56]. Qualsiasi strategia di sensibilizzazione basata sui polifenoli dipende quindi da un’attenta ottimizzazione del rapporto dosimetrico piuttosto che dalla semplice somministrazione concomitante. Analogamente, l’acido gallico ha potenziato la morte cellulare indotta dall’olaparib e ha attenuato la resistenza acquisita all’olaparib nelle cellule U2OS e in un derivato resistente all’olaparib (U2OS-PIR), inibendo l’angiogenesi e modulando cPARP, Bcl-2 e Bax [57], ampliando il repertorio di combinazioni di composti naturali applicabili alla ricerca sul trattamento dell’osteosarcoma. È stato dimostrato che il lenvatinib, un inibitore multichinasi approvato, induce cambiamenti correlati alla ferroptosi nelle cellule U2OS e 143B attraverso un asse p-STAT3/p53/xCT, rivelando un nuovo meccanismo mediante il quale questo agente può sopprimere la progressione dell’osteosarcoma al di là del suo ruolo canonico di inibitore dell’angiogenesi [19]. L’immunoterapia basata sulle cellule natural killer è stata valutata su un panel di linee di osteosarcoma, tra cui la linea U2OS; l’espressione del ligando NKG2D è risultata correlata all’efficienza di uccisione mediata dalle cellule NK, mentre l’interleuchina-2 somministrata per via aerosol ha migliorato l’attività delle cellule NK specifica per organo in vivo [20].

Uno screening farmacologico più ampio sui sarcomi, che ha coinvolto 63 linee cellulari umane e oltre 400 composti oncologici, ha documentato i profili di sensibilità ai farmaci della linea U2OS insieme ai dati sull’espressione genica e dei microRNA, fornendo un ricco riferimento farmacogenomico per il settore [21]. Il progetto di riferimento «Cancer Cell Line Encyclopedia» ha integrato dati relativi all’espressione genica, al numero di copie e al sequenziamento provenienti da quasi 950 linee, tra cui la U2OS, e li ha correlati ai profili di sensibilità ai farmaci per identificare biomarcatori predittivi della risposta [15]. Un successivo studio di panorama farmacogenomico ha mappato le associazioni di sensibilità ai farmaci sulle alterazioni indotte dal cancro in oltre 1.000 linee annotate, contestualizzando ulteriormente le risposte della linea U2OS all’interno del più ampio panorama oncologico [22].

L’asse miR-16-1-3p/MDM2/p53 è emerso come un importante regolatore dell’output della segnalazione del TGF-β1 nell’osteosarcoma. Xue et al. hanno dimostrato che la sovraespressione di miR-16-1-3p riduceva notevolmente il potenziale proliferativo e clonogenico delle cellule U2OS, mentre la sua combinazione con il trattamento con TGF-β potenziava fortemente l’arresto in fase G1 e quasi annullava la capacità di crescita tumorale [23]. Lo stesso studio ha mostrato che miR-16-1-3p inibiva il rimodellamento dell’actina indotto dal TGF-β e i cambiamenti associati alla transizione epiteliale-mesenchimale, e che la somministrazione combinata aumentava la sensibilità al cisplatino nelle cellule U2OS wild-type e riduceva il volume dei noduli tumorali e le metastasi nel modello della membrana corioallantoica del pollo, fornendo una visione meccanicistica di come questo microRNA sopprima il braccio pro-metastatico della segnalazione del TGF-β. È stato dimostrato che le vescicole extracellulari derivate dagli osteoblasti (OB-EV) alterano il comportamento delle cellule di osteosarcoma in modo dipendente dalla linea cellulare: nelle cellule U2OS hanno ridotto l’attività metabolica (di 1,30 volte) e la proliferazione (di 1,70 volte) aumentando al contempo l’apoptosi (di 1,15 volte), mentre la proliferazione delle cellule MG-63 è aumentata di 4,9 volte. La profilazione trascrittomica di accompagnamento è stata eseguita su cellule MNNG/HOS, dove sono stati individuati 296 geni espressi in modo differenziale, e gli autori propongono il trasporto di miRNA come meccanismo potenzialmente coinvolto, che richiede tuttavia una validazione funzionale [24]. La riprogrammazione metabolica nell’osteosarcoma è stata studiata tramite la trascrittomica a singola cellula, identificando la stanniocalcina-2 (STC2) come regolatore glicolitico centrale, convalidato funzionalmente nelle cellule MG-63 e U2OS mediante l’analisi del flusso extracellulare Seahorse [25].

Riparazione del DNA, regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno al DNA

La linea cellulare U2OS è uno dei modelli più ampiamente utilizzati nella ricerca sulla riparazione del DNA, soprattutto perché il suo background p53 wild-type consente di studiare l’intera gamma delle risposte al danno dipendenti da p53. Uno studio su scala genomica ha mappato il trascrittoma regolato dal ciclo cellulare delle cellule U2OS, identificando 2.140 trascritti espressi periodicamente corrispondenti a 1.871 geni unici in più cicli cellulari sincroni [52]. Combinando i dati ChIP-seq relativi al fattore di trascrizione G2/M FOXM1 con i dati ChIP-seq già pubblicati per E2F1, E2F4, E2F6, GABPA e del complesso DREAM, gli autori hanno dimostrato che FOXM1 attiva fortemente i promotori dei geni della fase G2/M e attiva solo debolmente quelli indotti nella fase S, e che un insieme fondamentale di geni del ciclo cellulare condiviso tra U2OS e HeLa è legato da molteplici fattori di trascrizione del ciclo cellulare. Il set di dati ha consolidato U2OS come secondo modello umano, caratterizzato in modo indipendente, per la mappatura del trascrittoma del ciclo cellulare e rimane un riferimento ampiamente utilizzato per gli studi sulla regolazione genica del ciclo di divisione cellulare umano.

Le mutazioni con guadagno di funzione in PPM1D/Wip1 — la fosfatasi che inattiva p53 — producono una Wip1 iperattiva e troncata all’estremità C-terminale e compromettono il checkpoint G1 dipendente da p53 a seguito di un danno al DNA; U2OS porta in forma eterozigote un allele troncante di questo tipo (p.Arg458Ter) [7] [61]. Ciò rende U2OS un modello utile per studiare come le troncature di Wip1 conferiscano un vantaggio selettivo di crescita attenuando la risposta al danno al DNA. La variabilità a livello di singola cellula nella risposta al danno al DNA è stata quantificata nelle cellule U2OS esposte a 2 Gy di fotoni; confrontando i focolai di 53BP1 e γH2AX nei nuclei gemelli di cellule binucleate, Płódowska et al. hanno dimostrato l’esistenza di un rumore stocastico da cellula a cellula nella formazione dei foci di riparazione, sovrapposto al danno al DNA distribuito casualmente, con il rumore che contribuisce per il 28% alla variabilità totale dei foci di 53BP1 e per il 50% a quella dei foci di γH2AX [26]. L’analisi dello scambio di cromatidi sorelle in linee di sarcoma dei tessuti molli, comprese le linee di controllo U2OS, ha confermato che la formazione endogena di γH2AX è correlata all’instabilità genomica e può predire le risposte ai trattamenti che danneggiano il DNA [27].

Le cellule U2OS sono state impiegate per studiare l’espansione somatica delle ripetizioni CAG nella malattia di Huntington. L’interruzione genetica della tasca di legame MSH3 Y245/K246 della tasca di legame dell’IDL ha ridotto significativamente l’interazione con il DNA e ha inibito l’espansione delle ripetizioni in una linea U2OS che esprimeva l’esone 1 mutante dell’HTT; inoltre, il blocco farmacologico dello stesso sito ha ridotto l’espansione delle ripetizioni nelle cellule U2OS e, cosa importante, ha anche rallentato l’espansione nei neuroni spinosi medi derivati da iPSC di pazienti affetti da malattia di Huntington [28]. La linea derivata U2OS DR-GFP è stata ampiamente utilizzata per saggi di riparazione mediante ricombinazione omologa, e sono state generate diverse linee derivate knockout — tra cui quelle con knockout di RAD52, TBK1 e OPTN — per analizzare componenti specifici delle vie di riparazione, tutte catalogate come voci figlie di CVCL_0042 [61]. Il soppressore tumorale TSC2 è stato identificato come un soppressore dei granuli di stress; in un preprint che riportava questo lavoro, la riduzione parziale di TSC2 mediata da siRNA nelle cellule U2OS non ha indotto la formazione spontanea di granuli di stress, in contrasto con la perdita completa osservata nei fibroblasti embrionali di topo, stabilendo che TSC2 è un regolatore dipendente dalla soglia dell’assemblaggio dei granuli di stress [29]. Anche gli screening su scala genomica per individuare delezioni omozigoti e alterazioni dei geni del complesso di polarità in pannelli di linee cellulari tumorali hanno incorporato i dati relativi alle cellule U2OS, contribuendo all’identificazione di geni tumorali recessivi e di firme di siti fragili [30] [31].

Biologia circadiana e regolazione genica

Le cellule U2OS sono diventate un modello di riferimento per la ricerca sull’orologio circadiano dei mammiferi. Queste cellule presentano ritmi circadiani robusti e autosufficienti e vengono abitualmente utilizzate con reporter a luciferasi dei geni dell’orologio per la luminometria in tempo reale. Burke et al. hanno utilizzato cellule U2OS che esprimono reporter a base di luciferasi dei geni dell’orologio per dimostrare che la caffeina allunga il periodo circadiano in modo dose-dipendente e hanno stabilito, attraverso analisi farmacologiche e knockdown con siRNA, che è la segnalazione del recettore dell’adenosina — piuttosto che l’attività del recettore della rianodina o della fosfodiesterasi — a determinare tale effetto [59]. Lo stesso sistema supporta lo screening chimico su larga scala: uno screening ad alta produttività di farmaci esistenti nelle cellule U2OS ha rilevato che circa il 5% alterava il periodo circadiano, identificando il deidroepiandrosterone come composto in grado di accorciare il periodo e implicando ABL1, ABL2 e la chinasi BCR nella regolazione del periodo [60]. Queste proprietà sono state ampiamente sfruttate per caratterizzare i meccanismi molecolari che regolano il ciclo di retroazione trascrizione-traduzione centrale BMAL1/CLOCK e le sue interazioni con le vie oncogeniche.

Un recente preprint ha studiato la natura circadiana endogena di c-MYC nelle cellule U2OS. Generando un reporter c-MYC e confrontandone la fase di oscillazione con quella dei reporter BMAL1 e PER2, Kalyanaraman et al. hanno riportato che il promotore di c-MYC oscilla ritmicamente nelle cellule U2OS — una linea con livelli intrinsecamente bassi di MYC — e oscilla fuori fase rispetto ai componenti principali dell’orologio [32]. Un modello computazionale basato su questi risultati ha suggerito che MYC agisca come un fattore di disturbo dell’orologio, la cui tempistica riduce al minimo il suo impatto negativo sulla regolazione circadiana — una scoperta che ha implicazioni per la comprensione di come la sovraespressione oncogenica di MYC perturbi la fisiologia circadiana. Trattandosi di una preprint, questo lavoro non ha ancora completato la revisione tra pari. Ciononostante, dimostra l’idoneità della linea U2OS a indagare contemporaneamente la funzione dell’oncogene e la regolazione circadiana.

La linea U2OS è telomerasi-negativa e mantiene i propri telomeri attraverso l’allungamento alternativo dei telomeri (ALT), il meccanismo basato sulla ricombinazione documentato per la prima volta in un sottogruppo di tumori e linee cellulari di origine tumorale da Bryan et al. [58]. Ciò la rende un modello standard per la ricerca sull’ALT, un meccanismo attivo in un sottogruppo di tumori, tra cui gli osteosarcomi. La linea è inoltre frequentemente impiegata negli studi sulle dinamiche delle modificazioni degli istoni, sull’architettura nucleare e sull’organizzazione della cromatina, grazie ai suoi nuclei di grandi dimensioni e alla sua trattabilità ottica. I derivati di istoni e pori nucleari marcati con fluorescenza — tra cui U2OS EGFP-H2B e diverse linee NUP96 marcate con CRISPR derivate da U2OS — hanno consentito l’imaging quantitativo della cromatina e dei processi di trasporto nucleare con elevata risoluzione spaziale [61].

Endocitosi e traffico intracellulare

La linea U2OS si è affermata come modello standard per lo studio dell’endocitosi mediata dalla clatrina (CME) e dell’attività della GTPasi dinamina, grazie alla sua robusta attività di internalizzazione dei recettori e alla sua idoneità per saggi quantitativi di CME basati sulla fluorescenza che misurano l’assorbimento della transferrina-Alexa594. Una serie di composti sulfonadin — arilsulfonammidi derivate da analoghi della dansilcadaverina — è stata caratterizzata come inibitori competitivi del GTP della dinamina I e della dinamina II utilizzando le cellule U2OS come piattaforma primaria per i test di CME [33]. L’analisi cinetica di Michaelis-Menten in questo sistema ha confermato il meccanismo di inibizione, e l’analogo più potente ha anche mostrato attività antiepilettica in modelli animali, posizionando i test CME basati su U2OS come strumento traslazionale per la scoperta di farmaci neurologici.

Separatamente, il bolinaquinone — un sesquiterpene idrossichinonico di origine marina — e i relativi analoghi naftochinonici sono stati valutati per l’attività inibitoria del CME nelle cellule U2OS; l’ottimizzazione strutturale guidata dalla teoria funzionale della densità ha prodotto analoghi con una potenza notevolmente migliorata sia contro la GTPasi della dinamina che contro il CME [34]. Questi studi dimostrano come i test CME basati sulle cellule U2OS costituiscano una piattaforma sensibile e riproducibile per gli studi sulla relazione struttura-attività degli inibitori dell’endocitosi. L’espressione costante dei recettori e la cinetica di internalizzazione prevedibile di questa linea cellulare la rendono un sistema cellulare privilegiato per questa classe di ricerca.

Il destino degli oligonucleotidi antisenso (ASO) dopo l’assorbimento cellulare è stato monitorato nelle cellule U2OS utilizzando la microscopia su cellule vive, misurazioni raziometriche del pH e la microscopia elettronica a scansione tridimensionale con fascio ionico focalizzato. In un preprint che riporta questo lavoro, Sitarska et al. hanno dimostrato che, anche in condizioni in cui l’RNA bersaglio veniva ridotto di oltre il 90%, meno del 4% degli ASO internalizzati raggiungeva il nucleo e che gli ASO si accumulavano negli endosomi tardivi, negli endolisosomi e nei lisosomi, dove inducevano una neutralizzazione luminale senza il reclutamento di galectina-3 né la rottura della membrana limitante [35]. Gli autori ipotizzano che la fuga produttiva avvenga invece in una fase più precoce dell’endocitosi, molto probabilmente negli endosomi precoci o di riciclaggio. Le cellule U2OS sono state utilizzate anche in un saggio di attivazione del GLP-1R — una linea U2OS che esprime biosensori Nomad sensibili al cAMP — per valutare gli effetti metabolici di un estratto di bergamotto formulato con fosfolipidi, dimostrando l’utilità della linea come piattaforma ingegnerizzata per l’espressione di recettori nella farmacologia dei prodotti naturali [36]. La tecnologia dei cibridi per lo studio delle mutazioni del DNA mitocondriale è stata perfezionata grazie alla convalida di derivati privi di mtDNA (ρ0) di HCT116, HT1080 e U2OS, recentemente sviluppati, come linee cellulari riceventi per la generazione di cibridi transmitochondriali [37].

Proteomica, genomica e piattaforme multi-omiche

La linea cellulare U2OS è stata un riferimento fondamentale nelle iniziative di proteomica su larga scala. Il primo profilo proteomico dedicato della linea U2OS è stato generato da Niforou et al. utilizzando l’elettroforesi bidimensionale su gel accoppiata alla spettrometria di massa MALDI: circa 3.000 spot sono stati estratti da due gel 2-DE e analizzati, consentendo l’identificazione di 237 prodotti genici distinti, tra cui 11 protooncogeni correlati allo stato canceroso della linea [16]. Successivi studi basati sulla spettrometria di massa hanno quantificato il proteoma assoluto di questa linea in interfase e mitosi — descritta nella pubblicazione come una linea cellulare umana comunemente utilizzata e assegnata a U2OS in Cellosaurus — mostrando l’espressione di almeno circa 10.000 proteine che coprono sette ordini di grandezza in termini di abbondanza cellulare, fino a 20 milioni di copie per cellula [38] [61]. La proteomica comparativa su undici linee cellulari comuni ha dimostrato che la U2OS condivide un nucleo di proteine espresse in modo ubiquitario, pur presentando variazioni specifiche per tipo cellulare nei sottogruppi funzionali [39].

La proteomica su larga scala della superficie cellulare, che utilizza la tecnologia Cell Surface Capture, ha catalogato il surfaceoma di U2OS insieme ad altri 40 tipi di cellule umane (41 tipi di cellule umane e 31 di topo in totale), fornendo una risorsa per l’identificazione di bersagli di superficie farmacologicamente accessibili [40]. Gli studi di tipizzazione HLA e di previsione dei neoepitopi hanno incluso la linea U2OS per supportare lo sviluppo di bersagli per l’immunoterapia antitumorale [41] [42]. La caratterizzazione mediante array proteico in fase inversa di oltre 650 linee cellulari tumorali ha incluso la linea U2OS, dimostrando che i dati fosfoproteomici forniscono un potere predittivo della sensibilità ai farmaci superiore a quello ottenibile dalle sole misurazioni dell’mRNA [43]. La mappa proteomica pan-tumorale, che copre 949 linee cellulari, ha ulteriormente integrato i dati proteomici di U2OS con screening di essenzialità CRISPR e dati sulla risposta ai farmaci, rivelando migliaia di biomarcatori proteici della vulnerabilità al cancro [44].

La caratterizzazione a livello di trascrittoma di 675 linee cellulari tumorali mediante sequenziamento dell’RNA ha catalogato fusioni geniche, firme mutazionali e l’espressione di sequenze non umane nella linea U2OS [45]. La caratterizzazione CCLE di nuova generazione ha ampliato la profilazione includendo dati sulla metilazione del DNA, sulle modificazioni degli istoni, sull’espressione dei microRNA e sullo splicing dell’RNA in 1.072 linee, con le cellule U2OS che hanno contribuito alle analisi integrative delle caratteristiche molecolari alla base delle risposte ai farmaci [46]. La proteomica quantitativa del pannello CCLE ha identificato una disregolazione delle vie metaboliche a livello proteico che non era evidente dai soli dati genomici o trascrittomici [47]. Il «Cell Painting», combinato con il «Thermal Proteome Profiling» nelle cellule U2OS, ha dimostrato di essere una potente strategia per dedurre il meccanismo d’azione dei farmaci, integrando la profilazione morfologica con il rilevamento imparziale dei bersagli proteici [17]. I set di dati proteomici delle cellule U2OS sono inoltre sottoposti a un controllo di qualità a livello di viroma: è stato sviluppato un flusso di lavoro di xeno-proteomica per il rilevamento non mirato di proteine virali nei dati proteomici come fase di screening generale; gli autori raccomandano che ogni set di dati proteomici cellulari venga sottoposto a test per individuare eventuali proteine non umane prima della pubblicazione [48]. L’analisi epigenomica integrativa dell’osteosarcoma che ha coinvolto le cellule U2OS ha identificato 350 geni con aberrazioni genetiche ed epigenetiche concordanti, approfondendo la comprensione del panorama regolatorio che governa la progressione dei tumori ossei [49]. L’espressione proteica nei microarray cellulari è stata valutata anche utilizzando cellule U2OS incorporate in matrici di agarosio, consentendo la profilazione simultanea di più linee cellulari in un formato di microarray tissutale [50]. Le prime risposte dei marcatori delle cellule U2OS agli estratti di un innesto osseo xenogenico rivestito di acido ialuronico sono state caratterizzate mediante qRT-PCR: RUNX2 è risultato sovraregolato di 2,61 volte (p = 0,01), mentre non è stato riportato alcun effetto significativo per COL1A1 e le differenze osservate nell’attività metabolica non sono rimaste significative dopo la correzione FDR [51]. Gli autori descrivono lo studio come esplorativo e ne sollecitano la validazione su cellule primarie e modelli in vivo.

Conclusione

U2OS (CVCL_0042) è una linea cellulare di osteosarcoma umano straordinariamente versatile che ha contribuito a progressi fondamentali nella ricerca sulle neoplasie ossee, nella biologia della riparazione del DNA, nella scienza dei ritmi circadiani, nella farmacologia dell’endocitosi e nella profilazione omica su larga scala. Il suo background TP53 wild-type, la morfologia epiteliale aderente, il rapido tempo di raddoppio e la caratterizzazione multi-omica approfondita ne fanno un modello sperimentale eccezionalmente ben supportato. Dai primi studi di tipizzazione HLA agli attuali screening funzionali basati su CRISPR e alla profilazione farmacologica tramite Cell Painting, U2OS si è continuamente adattata alle esigenze della comunità di ricerca biomedica. I ricercatori alla ricerca di un modello affidabile e ampiamente documentato per la biologia dell’osteosarcoma, la regolazione del ciclo cellulare, la risposta al danno al DNA o lo screening di composti ad alta produttività troveranno in U2OS uno strumento indispensabile. Esplora le specifiche complete o ordina le cellule U2OS direttamente su cytion.com.

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