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応用分野

骨肉腫の創薬および治療薬スクリーニング

U2OS細胞株は、骨肉腫に対する新規化合物および既存薬の転用化合物を評価するための主要なモデル系である。これまでの研究では、この細胞株を用いて、多様な天然物および合成化合物の抗腫瘍活性が検討されてきた。発芽後のジャトロファ・クルカス（Jatropha curcas）種子由来のI型リボソーム不活性化タンパク質であるカーシンCは、 発芽後のジャトロファ・クルカス（Jatropha curcas）種子由来のI型リボソーム不活性化タンパク質であるカーシンCは、ROSを介したアポトーシス、オートファジー、およびS期およびG2/M期の両方の細胞周期停止を通じてU2OS細胞の増殖を抑制することが示されており、その効果はERK経路の阻害に加え、JNKシグナル伝達の活性化に起因すると考えられている。 ROSスカベンジャーであるNACおよびJNK阻害剤SP600125は、それぞれこの反応を弱め、提案されたシグナル伝達カスケードを裏付けた[53]。 その後の研究により、U2OS細胞においてCurcin CがCurcinに比べて高い効力を示す理由は、主にLRP1を介したクラトリン依存性エンドサイトーシスによるものであり、Curcin Cはこの経路を利用できるが、Curcinは利用できないことが明らかになった。

天然アルカロイドであるアロペリンは、MG-63およびU2OS骨肉腫細胞の両方において増殖とコロニー形成能を抑制し、フローサイトメトリーによって確認されたようにアポトーシスを誘導し、スクラッチアッセイおよびトランスウェルアッセイにおいて浸潤を抑制するとともに、MMP-2、MMP-9、 PI3K、p-AKT1の発現を低下させた[54]。この研究は、天然アルカロイドが成長と転移能を同時に阻害し得る、複数の収束する経路を浮き彫りにした。 これとは別に、天然甘味料代謝産物であるステビオールは、用量依存的かつ時間依存的にU2OSの増殖を抑制することが示され、そのメカニズムの解明により、G1期の細胞周期停止およびBax/Bcl-2比の上昇によって示されるミトコンドリアアポトーシス経路が明らかになった [55] — これらの知見により、天然代謝産物は骨肉腫の化学予防研究における有力な候補として位置づけられている。

タンニン酸はU2OS細胞においてシスプラチンの細胞毒性を増強したが、その相互作用は比率に強く依存することが判明した： タンニン酸とシスプラチンの比率が90:10および85:15のときは相乗効果が観察されたのに対し、75:25および50:50の比率では拮抗作用が認められ、タンニン酸単独では正常なhFOB 1.19骨芽細胞を有意に抑制しなかった [56]。したがって、ポリフェノールに基づく感受性増強戦略は、単純な併用投与ではなく、投与比の慎重な最適化に依存する。 同様に、没食子酸はU2OS細胞およびオラパリブ耐性派生細胞（U2OS-PIR）において、オラパリブによる細胞死を増強し、獲得されたオラパリブ耐性を軽減し、血管新生を抑制し、cPARP、 Bcl-2およびBaxを調節した[57]。これにより、骨肉腫治療研究に適用可能な天然化合物の組み合わせのレパートリーが拡大した。 承認済みのマルチキナーゼ阻害剤であるレンバチニブは、p-STAT3/p53/xCT軸を介してU2OSおよび143B細胞においてフェロプトーシスに関連する変化を誘導することが示され、この薬剤が従来の血管新生阻害作用を超えて骨肉腫の進行を抑制し得る新たなメカニズムが明らかになった [19]。U2OSを含む一連の骨肉腫細胞株を対象に、ナチュラルキラー（NK）細胞を用いた免疫療法が評価され、NKG2Dリガンドの発現がNK細胞による殺傷効率と相関し、エアロゾル投与のインターロイキン-2がin vivoにおいて臓器特異的なNK細胞活性を向上させることが示された[20]。

63のヒト細胞株と400以上の抗がん化合物を網羅した、より広範な肉腫向け薬剤スクリーニングにより、U2OSの薬剤感受性プロファイルが遺伝子およびマイクロRNA発現データと共に記録され、この分野にとって豊富なファーマコゲノミクス参照資料が提供された[21]。 画期的な「Cancer Cell Line Encyclopedia」プロジェクトでは、U2OSを含む約950の細胞株からの遺伝子発現、コピー数、シーケンシングデータを統合し、これらを薬剤感受性プロファイルと相関させることで、治療反応を予測するバイオマーカーを特定した[15]。 その後のファーマコゲノミクス・ランドスケープ研究では、1,000以上のアノテーション付き細胞株にわたるがんに起因する変異と薬剤感受性の関連性をマッピングし、より広範な腫瘍学の領域においてU2OSの反応をさらに文脈化しました [22]。

miR-16-1-3p/MDM2/p53 軸は、骨肉腫における TGF-β1 シグナル伝達出力の重要な調節因子として浮上している。 Xueらは、miR-16-1-3pの過剰発現がU2OS細胞の増殖能およびクローン形成能を著しく低下させることを実証した。一方、TGF-β治療との併用により、G1期停止が強力に促進され、腫瘍の増殖能力がほぼ消失した [23]。 同研究では、miR-16-1-3pがTGF-βによるアクチンリモデリングおよび上皮間葉転換に関連する変化を抑制すること、 また、併用投与により野生型U2OS細胞におけるシスプラチン感受性が増加し、ニワトリ絨毛尿膜膜モデルにおいて腫瘍結節の体積および転移が減少したことが示され、このマイクロRNAがTGF-βシグナル伝達の転移促進経路をどのように抑制するかについて、メカニズム的な知見が得られた。 骨芽細胞由来の細胞外小胞（OB-EVs）は、細胞株に依存した形で骨肉腫細胞の挙動を変化させることが示された。 U2OS細胞では代謝活性（1.30倍）と増殖（1.70倍）を低下させ、アポトーシス（1.15倍）を増加させたのに対し、MG-63細胞では増殖が4.9倍に増加した。 併せてMNNG/HOS細胞においてトランスクリプトームプロファイリングが実施され、296個の遺伝子の発現に差異が認められた。著者らは、miRNAのシャトル現象が寄与するメカニズムの一つとして提唱しているが、これについては機能的な検証が依然として必要である[24]。 骨肉腫における代謝のリプログラミングは、単一細胞トランスクリプトミクスによって調査され、スタニオカルシン-2（STC2）が糖代謝の中核的な調節因子であることが特定され、Seahorse 細胞外フラックス分析を用いて MG-63 細胞および U2OS 細胞においてその機能が検証された [25]。

DNA修復、細胞周期制御、およびDNA損傷応答

U2OSは、DNA修復研究において最も広く使用されているモデルの一つである。その主な理由は、その野生型p53の背景により、p53依存性の損傷応答の全範囲を詳細に解析できる点にある。 ゲノム規模の研究により、U2OS の細胞周期制御トランスクリプトームがマッピングされ、複数の同期細胞周期にわたって、1,871 の固有の遺伝子に対応する 2,140 の周期的に発現する転写産物が同定された [52]。 G2/M転写因子FOXM1のChIP-seqデータと、E2F1、E2F4、 E2F6、GABPA、およびDREAM複合体に関する既発表のChIP-seqデータを組み合わせることで、著者らは、FOXM1がG2/M期遺伝子のプロモーターを強力に活性化させる一方で、S期に誘導される遺伝子のプロモーターをわずかにしか活性化しないこと、また、U2OSとHeLaに共通する細胞周期遺伝子のコアセットが、複数の細胞周期転写因子によって結合されていることを示した。 このデータセットにより、U2OSは細胞周期トランスクリプトームのマッピングを行うための、独立して特徴づけられた2番目の人類モデルとして確立され、現在もヒト細胞分裂周期の遺伝子制御研究において広く利用されている参照モデルとなっている。

p53を不活性化させるホスファターゼであるPPM1D/Wip1における機能獲得型変異は、C末端が欠失した過剰活性型のWip1を生成し、DNA損傷後のp53依存性G1チェックポイントを損なう。 U2OS細胞は、このような切断型対立遺伝子（p.Arg458Ter）をヘテロ接合体として保有している[7] [61]。このため、U2OS細胞は、Wip1の切断がDNA損傷応答を弱めることで、いかにして選択的な増殖優位性をもたらすかを研究するための有用なモデルとなっている。 2 Gyの光子に曝露されたU2OS細胞において、DNA損傷応答における単一細胞間の変動が定量化された。二核細胞の姉妹核における53BP1およびγH2AXのフォーカスを比較することにより、 Płódowskaらは、ランダムに分布するDNA損傷に重畳する、修復フォーカスの形成における細胞間の確率的ノイズを実証し、このノイズが53BP1フォーカスの総変動の28％、γH2AXフォーカスの50％を占めることを明らかにした[26]。 U2OS対照株を含む軟部組織肉腫細胞株における姉妹染色分体交換解析により、内因性のγH2AX形成がゲノム不安定性と相関し、DNA損傷治療への反応を予測し得ることが確認された[27]。

ハンチントン病における体細胞性CAG反復配列の拡張を調査するために、U2OS細胞が用いられた。MSH3のY245/K246 IDL結合ポケットの遺伝子破壊は、変異型HTTエクソン1を発現するU2OS細胞株においてDNA相互作用を著しく減少させ、反復配列の拡張を阻止した。また、同部位の薬理学的遮断は、U2OS細胞における反復配列の拡張を抑制しただけでなく、重要なことに、HD患者由来のiPS細胞から樹立された中型棘細胞においても拡張を遅らせた[28]。 U2OS DR-GFP派生細胞株は、相同組換え修復アッセイに広く使用されており、特定の修復経路の構成要素を解析するために、RAD52、TBK1、OPTNのノックアウトを含む複数のノックアウト派生株が作成されており、これらはすべてCVCL_0042の子エントリとしてカタログ化されている [61]としてカタログ化されている。TSC2腫瘍抑制遺伝子はストレス顆粒抑制因子として同定された。 この研究を報告したプレプリントによれば、U2OS細胞においてsiRNAを介したTSC2の部分的な減少は、マウス胚性線維芽細胞で観察された完全な喪失とは対照的に、自発的なストレス顆粒を誘導しなかった。これにより、TSC2はストレス顆粒の形成における閾値依存性の調節因子であることが確立された[29]。 がん細胞株パネルにおけるホモ接合欠失および極性複合体遺伝子の破壊に関するゲノムワイドスクリーニングにもU2OSデータが組み込まれており、劣性がん遺伝子や脆弱部位のシグネチャの同定に寄与している[30] [31]。

概日生物学と遺伝子制御

U2OSは、哺乳類の概日時計研究における主要なモデルとなっている。これらの細胞は、強固で自己維持型の概日リズムを示し、リアルタイム発光測定のために概日時計遺伝子のルシフェラーゼレポーターと組み合わせて日常的に使用されている。 Burkeらは、時計遺伝子ルシフェラーゼレポーターを発現するU2OS細胞を用いて、カフェインが用量依存的に概日周期を延長することを示し、薬理学的解析およびsiRNAによるノックダウンを通じて、この効果はリアノジン受容体やホスホジエステラーゼ活性ではなく、アデノシン受容体シグナル伝達によるものであることを明らかにした [59]。 この同じシステムは、大規模な化学物質スクリーニングにも対応している。U2OS細胞を用いた既存薬剤のハイスループットスクリーニングにより、約5％の薬剤が概日周期を変化させることが判明し、デヒドロエピアンドロステロンが周期を短縮する化合物であることが特定され、ABL1、ABL2、およびBCRキナーゼが周期の調節に関与していることが示唆された [60]。 これらの特性は、中核となるBMAL1/CLOCK転写・翻訳フィードバックループおよびその発癌経路との相互作用を支配する分子メカニズムを解明するために、広く活用されてきた。

最近のプレプリントでは、U2OS 細胞における c-MYC の内因性概日特性について調査が行われました。 c-MYCレポーターを作成し、その振動位相をBMAL1およびPER2レポーターと比較した結果、Kalyanaramanらは、c-MYCプロモーターが、本来MYCレベルが低いU2OS細胞においてリズミカルに振動し、中核時計成分に対して位相がずれて振動することを報告した [32]。これらの知見に基づいて構築された計算モデルは、MYCが時計の撹乱因子として作用し、そのタイミングが概日リズムの維持に対する悪影響を最小限に抑えていることを示唆しており、この知見は、発癌性MYCの過剰発現が概日生理機能をどのように乱すかを理解する上で重要な意味を持つ。 本研究はプレプリントであるため、まだ査読は完了していない。とはいえ、この研究は、U2OS細胞株が、発がん遺伝子の機能と概日調節を同時に解明するのに適していることを示している。

U2OSはテロメラーゼ陰性であり、ブライアンら[58]によって一部の腫瘍および腫瘍由来細胞株で初めて報告された、組換えに基づくメカニズムである「代替テロメア伸長（ALT）」を通じてテロメアを維持している。 このため、U2OSはALT研究の標準モデルとなっており、このメカニズムは骨肉腫を含む一部のがんにおいて活性化している。また、この細胞株は、その大きな核と光学的な扱いやすさを活かして、ヒストン修飾の動態、核構造、およびクロマチン組織の研究にも頻繁に用いられている。 蛍光標識されたヒストンおよび核孔タンパク質誘導体（U2OS EGFP-H2Bや、U2OS由来の複数のCRISPR標識NUP96系統など）により、高い空間分解能でクロマチンおよび核内輸送プロセスの定量的イメージングが可能となった[61]。

エンドサイトーシスおよび細胞内輸送

U2OSは、その強力な受容体内取り込み活性と、トランスフェリン-Alexa594の取り込みを測定する定量的蛍光ベースのCMEアッセイへの適性により、クラトリン依存性エンドサイトーシス（CME）およびダイナミンGTPase活性の研究における標準モデルとして台頭してきた。 一連のスルフォナジン化合物（ダンシルカダベリン類似体から派生したアリールスルホンアミド）は、U2OS 細胞を主要な CME アッセイプラットフォームとして用いて、GTP 競合型ダイナミン I およびダイナミン II 阻害剤として特性評価された [33]。 このシステムにおけるミカエリス・メンテン速度論的解析により、阻害メカニズムが確認され、最も強力な類似体は動物モデルにおいて抗てんかん活性も示したことから、U2OS を用いた CME アッセイは、神経系創薬のためのトランスレーショナルなツールとしての地位を確立した。

これとは別に、海洋由来のヒドロキシキノンセスキテルペンであるボリナキノンおよび関連するナフトキノン類似体について、U2OS細胞におけるCME阻害活性が評価された。密度汎関数理論に基づく構造最適化により、ダイナミンGTPaseおよびCMEの両方に対して効力が大幅に改善された類似体が得られた [34]。これらの研究は、U2OS細胞を用いたCMEアッセイが、エンドサイトーシス阻害剤の構造活性相関（SAR）研究において、高感度かつ再現性の高いプラットフォームとして機能することを示している。この細胞株は、受容体の発現が安定しており、内部化の動態も予測可能であるため、この種の研究において好ましい細胞系となっている。

細胞内取り込み後のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の動態は、U2OS細胞において、生細胞顕微鏡観察、比色pH測定、および3次元集束イオンビーム走査型電子顕微鏡を用いて追跡された。この研究を報告したプレプリントにおいて、 Sitarskaらは、標的RNAを90%以上減少させる条件下であっても、取り込まれたASOのうち核に到達したのは4%未満であり、ASOは後期エンドソーム、エンドリソソーム、およびリソソームに蓄積し、そこでガレクチン-3の動員や制限膜の破裂を伴わずに内腔の中和を誘導したことを示した [35]。著者らは、実効的な脱出はむしろエンドサイトーシスのより早い段階、おそらく初期エンドソームまたはリサイクリングエンドソームにおいて発生すると提唱している。 また、U2OS細胞は、cAMP感受性Nomadバイオセンサーを発現するU2OS細胞株を用いたGLP-1R活性化アッセイにも使用され、リン脂質製剤化されたベルガモット抽出物の代謝効果を評価し、天然物薬理学のための遺伝子改変受容体発現プラットフォームとしての同細胞株の有用性が実証された[36]。 ミトコンドリアDNA変異の研究のためのサイブリッド技術は、HCT116、HT1080、およびU2OSの新たに開発されたmtDNAフリー（ρ0）派生株を、トランスミトコンドリアル・サイブリッド生成のための受容体細胞株として検証することで、さらなる進展を遂げた[37]。

プロテオミクス、ゲノミクス、およびマルチオミクス・プラットフォーム

U2OSは、大規模プロテオミクス研究において重要な参照細胞株となっている。U2OSの最初の専用プロテオームプロファイルは、Niforouらによって、2次元ゲル電気泳動とMALDI質量分析法を組み合わせた手法を用いて作成された： 2枚の2次元電気泳動（2-DE）ゲルから約3,000個のスポットが切り出され、分析された結果、237種類の異なる遺伝子産物が同定され、その中にはこの細胞株のがん状態に関連する11個の癌原遺伝子が含まれていた[16]。 その後の質量分析法に基づく研究では、この細胞株の間期および有糸分裂における絶対プロテオームが定量化された。この細胞株は、当該論文では「一般的に使用されるヒト細胞株」として記述され、CellosaurusではU2OSとして分類されており、細胞内存在量が7桁の範囲に及ぶ少なくとも約10,000種類のタンパク質の発現が確認され、 1細胞あたり最大2,000万コピーに及ぶことが示された[38] [61]。11の一般的な細胞株を対象とした比較プロテオミクスにより、U2OSは普遍的に発現するタンパク質の中核を共有しつつ、機能的なサブセットにおいて細胞タイプ特異的な変動を示すことが明らかになった[39]。

Cell Surface Capture技術を用いた大規模な細胞表面プロテオミクスにより、U2OSおよび他の40種類のヒト細胞タイプ（合計でヒト41種類、マウス31種類）のサーフェスオームがカタログ化され、薬理学的にアクセス可能な表面標的を同定するためのリソースが提供された[40]。 HLAタイピングおよびネオエピトープ予測の研究では、がん免疫療法の標的開発を支援するためにU2OSが組み込まれた[41] [42]。 650以上のがん細胞株を対象とした逆相タンパク質アレイによる特性評価にはU2OSが含まれており、リン酸化プロテオミクスデータが、mRNA測定のみから得られるものを上回る薬剤感受性の予測能力を持つことが実証された[43]。 949の細胞株を網羅する汎がんプロテオミクスマップでは、U2OSのプロテオミクスデータをCRISPR必須性スクリーニングおよび薬剤反応データとさらに統合し、がんの脆弱性を示す数千のタンパク質バイオマーカーを明らかにした[44]。

RNAシーケンシングによる675のがん細胞株のトランスクリプトームワイドな解析により、U2OSにおける遺伝子融合、変異シグネチャ、および非ヒト配列の発現がカタログ化された[45]。 次世代CCLE解析により、1,072の細胞株にわたるDNAメチル化、ヒストン修飾、マイクロRNA発現、およびRNAスプライシングデータがプロファイリングに組み込まれ、U2OSは薬剤応答の基盤となる分子的特徴の統合的解析に貢献した[46]。 CCLEパネルに対する定量的プロテオミクス解析により、ゲノムデータやトランスクリプトームデータだけでは明らかにならなかった、タンパク質レベルでの経路の調節異常が同定された[47]。U2OS細胞における「セル・ペインティング」と「サーマル・プロテオーム・プロファイリング」の組み合わせは、形態学的プロファイリングとバイアスのないタンパク質ターゲット検出を統合することで、薬剤の作用機序を推定するための強力な戦略であることを実証した [17]。U2OSプロテオミクスデータセットは、バイロームレベルの品質管理の対象ともなっている。プロテオミクスデータ中のウイルスタンパク質を非標的検出するための「異種プロテオミクス」ワークフローが一般的なスクリーニング手順として開発され、著者らは、すべての細胞プロテオームデータセットについて、発表前に非ヒトタンパク質の有無を検査することを推奨している[48]。 U2OSを組み込んだ骨肉腫の統合的エピゲノム解析により、遺伝的およびエピゲノム的な異常が一致する350個の遺伝子が同定され、骨腫瘍の進行を支配する調節メカニズムの理解が深められた[49]。 また、アガロースマトリックスに封入されたU2OS細胞を用いて、細胞マイクロアレイにおけるタンパク質発現を評価し、組織マイクロアレイ形式で複数の細胞株の同時プロファイリングを可能にした[50]。ヒアルロン酸でコーティングされた異種骨移植片の抽出物に対するU2OS細胞の初期マーカー応答をqRT-PCRにより解析したところ、 RUNX2は2.61倍の上昇（p = 0.01）を示したが、COL1A1については有意な影響は報告されず、代謝活性における観察された差異はFDR補正後には有意でなくなった[51]。 著者らは本研究を探索的研究と位置づけ、初代細胞およびin vivoモデルにおける検証の必要性を訴えている。

結論

U2OS（CVCL_0042）は、骨腫瘍研究、DNA修復生物学、概日リズム科学、エンドサイトーシス薬理学、および大規模オミクスプロファイリングにおける基礎的な進歩に貢献してきた、極めて汎用性の高いヒト骨肉腫細胞株である。 その野生型TP53の背景、付着性上皮形態、短い倍加時間、そして詳細なマルチオミクス解析により、U2OSは極めて信頼性の高い実験モデルとなっています。初期のHLAタイピング研究から、現代のCRISPRを用いた機能スクリーニングやセルペインティングによる薬剤プロファイリングに至るまで、U2OSは生物医学研究コミュニティのニーズに絶えず適応してきました。 骨肉腫の生物学、細胞周期の制御、DNA損傷応答、あるいはハイスループット化合物スクリーニングのための、信頼性が高く、詳細なデータが蓄積されたモデルを求める研究者にとって、U2OSは不可欠なツールとなるでしょう。詳細な仕様をご覧になるか、cytion.comからU2OS細胞を直接ご注文ください。

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