Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Vėžio kamieninių ląstelių žymenys: Jų identifikavimas ir funkcinis patvirtinimas: kamieninių ląstelių ženklai: identifikavimas ir funkcinis patvirtinimas

Vėžio kamieninių ląstelių hipotezėje teigiama, kad navikuose yra hierarchiškai organizuotos ląstelių populiacijos, o nedidelis ląstelių pogrupis pasižymi į kamienines panašiomis savybėmis, įskaitant savaiminį atsinaujinimą, diferenciacijos gebėjimą ir gebėjimą inicijuoti naviką. Žymenų, patikimai atskiriančių CSC nuo pagrindinių naviko ląstelių, nustatymas turi didelę reikšmę siekiant suprasti naviko biologiją, prognozuoti atsparumą gydymui ir kurti gydymą, nukreiptą į naviko augimo ir atsinaujinimo priežastis. Norint, kad ši sritis būtų plėtojama ir taikoma klinikinėje praktikoje, labai svarbu nustatyti ir griežtai patvirtinti CSC žymenis.

Svarbiausia išvada	Išsamesnė informacija
Paviršiaus žymenų identifikavimas	Vėžio kamieninės ląstelės atpažįstamos pagal paviršiaus žymenis, leidžiančius jas izoliuoti ir funkciškai apibūdinti
Bendrieji CSC žymenys	CD44, CD133, ALDH aktyvumas ir audiniams būdingi žymenys, priklausantys nuo naviko tipo
Funkcinis patvirtinimas	Ribinio praskiedimo transplantacijos bandymais nustatomas gebėjimas inicijuoti naviką
Kombinacinės strategijos	CSC žymenys gali nustatyti persidengiančias, bet skirtingas populiacijas, kurioms reikia taikyti kombinuotus žymenų metodus
Vienos ląstelės įžvalgos	Vienos ląstelės technologijos atskleidžia CSC heterogeniškumą ir plastiškumą, dėl kurio kyla sunkumų statiniams žymenų apibrėžimams

Paviršiaus žymenimis pagrįstas CSC identifikavimas

CD44 yra vienas iš plačiausiai naudojamų CSC žymenų įvairiuose navikų tipuose. Šis ląstelių paviršiaus glikoproteinas veikia kaip hialurono rūgšties receptorius ir dalyvauja ląstelių sukibimo, migracijos ir signalizavimo procesuose. CD44⁺ ląstelės pasižymi didesniu navikiniu pajėgumu sergant krūties, galvos ir kaklo, kasos ir kitais vėžiniais susirgimais. Alternatyvaus splaisingo būdu susidariusios izoformos (CD44v) tam tikrais atvejais dar labiau išskiria CSC populiacijas.

CD133 (Prominin-1) iš pradžių buvo identifikuotas kaip hematopoetinių kamieninių ląstelių žymuo, o vėliau pripažintas kaip CSC žymuo smegenų navikuose, storosios žarnos vėžyje ir kituose piktybiniuose susirgimuose. CD133⁺ glioblastomos ląstelės pasižymi didesniu savęs atnaujinimo, neurosferų formavimosi ir naviko inicijavimo gebėjimu. Tačiau CD133 raiška gali skirtis priklausomai nuo auginimo sąlygų ir gali skirtis ne nuo visų navikų tipų CSC.

CD44⁺/CD24ˡᵒʷ- fenotipas identifikuoja krūties vėžio kamienines ląsteles, pasižyminčias geresniu mamosferos formavimusi ir ksenograftinio naviko inicijavimo gebėjimu. Šis žymenų derinys padeda atskirti CSC efektyviau nei bet kuris iš žymenų atskirai, o tai rodo kombinuotų žymenų strategijų vertę. Tačiau CSC fenotipai gali skirtis tarp krūties vėžio potipių, todėl reikia patvirtinti konkretaus potipio žymenį.

Funkcinių žymenų metodai

ALDH (aldehido dehidrogenazės) aktyvumas, matuojamas ALDEFLUOR testu, yra funkcinis CSC žymuo, nepriklausantis nuo paviršiaus fenotipo. Ląstelės, turinčios daug ^ALDH, pasižymi didesniu gebėjimu inicijuoti navikus, savaime atsinaujinti ir atsparumu gydymui įvairiuose vėžio tipuose, įskaitant krūties, plaučių ir hematologinius piktybinius navikus. ALDH derinamas su paviršiaus žymenimis, kad būtų galima geriau praturtinti CSC.

Šalutinės populiacijos (SP) ląstelės, identifikuojamos pagal Hoechst 33342 dažų nutekėjimą, yra dar vienas funkcinis CSC žymuo. Šios ląstelės išreiškia ATP jungiančių kasečių pernešėjus, kurie išplauna DNR jungiantį dažiklį, todėl tėkmės citometrijos diagramose susidaro atskira "šoninė" populiacija. SP ląstelės pasižymi didesniu gebėjimu inicijuoti naviką ir atsparumu gydymui, o vaistų nutekėjimo aktyvumas gali prisidėti prie atsparumo chemoterapijai.

Gebėjimas formuoti sferas neadherentiškomis sąlygomis be serumo yra savęs atnaujinimo pakaitalas. Vėžio sferų kultūrose gausėja ląstelių, turinčių CSC žymenų ir pasižyminčių didesniu naviko giminingumu. Atliekant serijinį rutulinį pasiskirstymą toliau atrenkamos savaime atsinaujinančios CSC ir kiekybiškai įvertinamas kamieninių ląstelių dažnis atliekant ribinio skiedimo analizę.

Navikui būdingi CSC žymenys

Galvos smegenų naviko kamieninės ląstelės atpažįstamos pagal CD133, nestino ir Sox2 raišką, atspindinčią nervinių kamieninių ląstelių savybes. CD15 (SSEA-1) žymi glioblastomos kamieninių ląstelių poaibį, o CD49f identifikuoja į kamienines ląsteles panašias ląsteles agresyviose gliomose. Nervų kamieninių ląstelių žymenų ir smegenų navikų CSC žymenų sutapimas atspindi galimą šių piktybinių navikų kilmės ląstelę.

Storosios žarnos vėžio kamieninės ląstelės išreiškia CD133, CD44 ir EpCAM derinius. Lgr5, Wnt taikinio genas, žymintis žarnyno kamienines ląsteles, identifikuoja kolorektalinio vėžio CSC, pasižyminčias didesniu naviko inicijavimo gebėjimu. Lgr5⁺ CSC nustatymas rodo, kad storosios žarnos CSC gali atsirasti iš normalių žarnyno kamieninių ląstelių, įgijusių onkogeninių mutacijų.

Ūminės mieloidinės leukemijos (ŪML) leukeminės kamieninės ląstelės (LKL) yra CD34⁺CD38- populiacijoje, panašioje į normalias kamienines kraujodaros ląsteles. HL-60 ląstelės yra ūminės promielocitinės leukemijos modeliai, o K562 ląstelės - lėtinės mieloidinės leukemijos su BCR-ABL valdoma hierarchija. Jurkat ląstelės leidžia atlikti T ląstelių ūminės limfoblastinės leukemijos CSC tyrimus.

Funkcinis patvirtinimas atliekant ksenotransplantaciją

Auksinis CSC patvirtinimo standartas yra naviko inicijavimas imunodeficitinėse pelėse. Ribinio praskiedimo transplantacijos tyrimais kiekybiškai įvertinamas naviką inicijuojančių ląstelių dažnis žymenimis apibrėžtose populiacijose. CSC praturtintos frakcijos inicijuoja navikus esant mažesniam ląstelių skaičiui nei didžiosios naviko ląstelės, o tai rodo didesnį naviko inicijavimo gebėjimą. Šis dažnio skirtumas yra funkcinis CSC praturtinimo kandidatų žymenimis įrodymas.

Serijinė transplantacija įrodo savęs atnaujinimo gebėjimą. Iš CSC populiacijų inicijuoti navikai iš naujo rūšiuojami ir persodinami, kad būtų įrodyta, jog CSC atsinaujina ir atkuria naviko heterogeniškumą. Ilgalaikis naviko inicijavimas per kelias transplantatų kartas patvirtina ilgalaikį savaiminį atsinaujinimą, leidžiantį atskirti tikruosius CSC nuo tranzitinių amplifikuojančių progenitorių.

Diferenciacijos gebėjimas vertinamas parodant, kad CSC inicijuotuose navikuose yra ląstelių, neturinčių CSC žymenų. Fenotipinio heterogeniškumo atkūrimas iš išgrynintų CSC populiacijų patvirtina diferenciacijos gebėjimą. Linijų sekimas naudojant genetinio žymėjimo sistemas suteikia papildomų įrodymų apie CSC diferenciaciją susiformavusiuose navikuose.

Vienos ląstelės technologijos ir CSC heterogeniškumas

Vienos ląstelės RNR sekos nustatymas atskleidžia CSC populiacijų transkriptominį heterogeniškumą, kurį masinė analizė užgožia. Kompiuterinė trajektorijų analizė nustato diferenciacijos kelius ir tarpines būsenas tarp CSC ir diferencijuotų palikuonių. Ši analizė atskleidžia, kad CSC būsenos egzistuoja ne kaip atskiri, stabilūs fenotipai, o kaip kontinuumas.

Plastiškumas tarp CSC ir ne CSC būsenų meta iššūkį statiškais žymenimis pagrįstiems CSC apibrėžimams. Ne-CSC gali virsti CSC, esant atitinkamoms sąlygoms, įskaitant mikroaplinkos signalus ir terapinį stresą. Šis plastiškumas reiškia, kad norint visiškai išnaikinti naviką gali tekti imtis priemonių ir prieš esamus CSC, ir prieš galimus CSC atsinaujinimo šaltinius.

Erdvinė transkriptomika lokalizuoja CSCs naviko struktūroje, atskleisdama nuo nišos priklausomą CSC pasiskirstymą. Perivaskulinėse nišose, hipoksiškose srityse ir naviko ir stromos sąsajose yra CSC populiacijos, kurioms įtaką daro vietiniai mikroaplinkos veiksniai. Supratus nišų indėlį į CSC palaikymą, galima sukurti strategijas, skirtas CSC palaikymui nutraukti.

CSC žymenys ir atsparumas gydymui

CSC populiacijos pasižymi didesniu atsparumu įprastinei chemoterapijai ir spinduliavimui dėl įvairių mechanizmų, įskaitant vaistų nutekėjimą, sustiprintą DNR taisymą, ramybę ir antiapoptozinį signalizavimą. Daug CSC žymenų turinčios populiacijos išgyvena citotoksinį gydymą ir gali lemti naviko atsinaujinimą. Šis atsparumas gydymui suteikia papildomą funkcinį CSC tapatybės patvirtinimą.

Tikslinės terapijos, nukreiptos prieš CSC žymenis arba CSC praturtintus kelius, tikslas - pašalinti naviką inicijuojančias ląsteles. Prieš CD44 nukreipti antikūnai, į CD133 nukreipti metodai ir ALDH inhibitoriai pradėti naudoti ikiklinikinėje ir ankstyvojoje klinikinėje praktikoje. Alternatyvi strategija - diferenciacijos terapija, priverčianti CSC pereiti prie netumorigeninių fenotipų.

Kietųjų navikų ląstelių linijos yra CSC tyrimų ir terapijos kūrimo modeliai. HCT116 ląstelės leidžia atlikti storosios žarnos vėžio CSC tyrimus, o A549 ląstelės ir NCI-H460 ląstelės - plaučių vėžio CSC tyrimus. U87MG ląstelės yra glioblastomos CSC modeliai smegenų navikų tyrimams.

Kokybės kontrolė ir standartizavimas

Standartizuoti srauto citometrijos protokolai užtikrina atkuriamą CSC žymenų analizę. Nuoseklūs antikūnų klonai, fluorochromų konjugatai ir užtvarų strategijos leidžia palyginti skirtingus tyrimus. Įtraukus atitinkamas kontrolės priemones, įskaitant izotipo kontrolę ir fluorescencijos minus vienas (FMO) kontrolę, užtikrinamas tikslus žymenų teigiamų populiacijų nustatymas.

Ląstelių linijos autentiškumo nustatymas patvirtina ląstelių linijos tapatumą prieš atliekant CSC žymenų tyrimus. Mikoplazmos testavimas apsaugo nuo užteršimo, kuris keičia CSC žymenų raišką ir funkcines savybes. CM-1 užšaldymo terpė leidžia kaupti CSC praturtintas populiacijas ilgalaikiams tyrimams.

Išvada

Vėžio kamieninių ląstelių žymenų nustatymas tebėra labai svarbus siekiant suprasti naviko hierarchiją, numatyti atsaką į gydymą ir kurti į CSC nukreiptus gydymo būdus. Nors buvo pasiūlyta daugybė žymenų įvairių tipų navikams, griežtas funkcinis patvirtinimas atliekant ribinio praskiedimo transplantaciją, serijinį pasiskirstymą ir diferenciacijos įvertinimą leidžia nustatyti tikrąjį CSC tapatumą. Vienos ląstelės technologijos atskleidžia anksčiau neįvertintą CSC heterogeniškumą ir plastiškumą, o tai yra iššūkis statiškiems žymenimis pagrįstiems CSC apibrėžimams. Žymenimis pagrįsto išskyrimo integravimas su funkciniu ir molekuliniu apibūdinimu suteikia visapusišką požiūrį, būtiną norint pritaikyti CSC biologiją geresniam vėžio gydymui.