Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Δείκτες καρκινικών βλαστικών κυττάρων: Κέλυφος Καρκίνου: Προσδιορισμός και λειτουργική επικύρωση

Η υπόθεση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (CSC) προτείνει ότι οι όγκοι περιέχουν ιεραρχικά οργανωμένους κυτταρικούς πληθυσμούς, με ένα μικρό υποσύνολο κυττάρων που διαθέτουν ιδιότητες που μοιάζουν με βλαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της αυτοανανέωσης, της ικανότητας διαφοροποίησης και της ικανότητας έναρξης του όγκου. Ο προσδιορισμός δεικτών που διακρίνουν αξιόπιστα τα CSC από τα κύτταρα του όγκου έχει βαθιές επιπτώσεις στην κατανόηση της βιολογίας του όγκου, στην πρόβλεψη της αντίστασης στη θεραπεία και στην ανάπτυξη θεραπειών που στοχεύουν στη ρίζα της ανάπτυξης και της υποτροπής του όγκου. Ο προσδιορισμός και η αυστηρή λειτουργική επικύρωση των δεικτών CSC παραμένουν ουσιώδεις για την πρόοδο αυτού του τομέα προς την κλινική εφαρμογή.

Βασικά συμπεράσματα	Λεπτομέρειες
Προσδιορισμός επιφανειακών δεικτών	Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα ταυτοποιούνται με επιφανειακούς δείκτες που επιτρέπουν την προοπτική απομόνωση και τον λειτουργικό χαρακτηρισμό
Κοινοί δείκτες CSC	CD44, CD133, δραστικότητα ALDH και δείκτες ειδικοί για κάθε ιστό που ποικίλλουν ανάλογα με τον τύπο του όγκου
Λειτουργική επικύρωση	Δοκιμές μεταμόσχευσης με περιοριστική αραίωση καθορίζουν την ικανότητα έναρξης όγκων
Συνδυαστικές στρατηγικές	Οι δείκτες CSC μπορεί να εντοπίζουν αλληλοεπικαλυπτόμενους αλλά διακριτούς πληθυσμούς που απαιτούν συνδυαστικές προσεγγίσεις δεικτών
Ενδείξεις ενός κυττάρου	Οι τεχνολογίες μεμονωμένων κυττάρων αποκαλύπτουν την ετερογένεια και την πλαστικότητα των CSC που αμφισβητούν τους στατικούς ορισμούς των δεικτών

Ταυτοποίηση CSC με βάση επιφανειακούς δείκτες

Το CD44 αποτελεί έναν από τους πιο ευρέως χρησιμοποιούμενους δείκτες CSC σε διάφορους τύπους όγκων. Αυτή η γλυκοπρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας λειτουργεί ως υποδοχέας για το υαλουρονικό οξύ και συμμετέχει στην κυτταρική προσκόλληση, τη μετανάστευση και τη σηματοδότηση. Τα κύτταρα CD44⁺ επιδεικνύουν αυξημένη καρκινική ικανότητα σε καρκίνους του μαστού, της κεφαλής και του τραχήλου, του παγκρέατος και άλλους καρκίνους. Οι παραλλαγμένες ισομορφές (CD44v) που παράγονται με εναλλακτικό μάτισμα διακρίνουν περαιτέρω τους πληθυσμούς CSC σε ορισμένα πλαίσια.

Το CD133 (Prominin-1) ταυτοποιήθηκε αρχικά ως δείκτης αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων και στη συνέχεια αναγνωρίστηκε ότι χαρακτηρίζει CSC σε όγκους του εγκεφάλου, καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλες κακοήθειες. Τα κύτταρα CD133⁺ από γλοιοβλάστωμα επιδεικνύουν αυξημένη αυτοανανέωση, σχηματισμό νευροσφαιρών και ικανότητα έναρξης όγκου. Ωστόσο, η έκφραση του CD133 μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τις συνθήκες καλλιέργειας και μπορεί να μην διακρίνει καθολικά τα CSCs σε όλους τους τύπους όγκων.

Ο φαινότυπος CD44⁺/CD24ˡᵒʷ- προσδιορίζει τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του μαστού με ενισχυμένο σχηματισμό μαστόσφαιρας και ικανότητα έναρξης όγκου σε ξενομόσχευμα. Αυτός ο συνδυασμός δεικτών διακρίνει τα CSC πιο αποτελεσματικά από ό,τι οποιοσδήποτε δείκτης από μόνος του, καταδεικνύοντας την αξία των συνδυαστικών στρατηγικών δεικτών. Ωστόσο, οι φαινότυποι των CSC μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των υποτύπων του καρκίνου του μαστού, γεγονός που απαιτεί επικύρωση δεικτών ειδικά για τον υποτύπο.

Προσεγγίσεις λειτουργικών δεικτών

Η δραστικότητα της ALDH (αφυδρογονάση της αλδεΰδης) που μετράται με τη δοκιμασία ALDEFLUOR παρέχει έναν λειτουργικό δείκτη CSC, ανεξάρτητο από τον επιφανειακό φαινότυπο. Τα κύτταρα με υψηλή περιεκτικότητα σε ^ALDH επιδεικνύουν αυξημένη ικανότητα εκκίνησης όγκων, αυτοανανέωσης και ανθεκτικότητας στη θεραπεία σε πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, των πνευμόνων και των αιματολογικών κακοηθειών. Η ALDH συνδυάζεται με επιφανειακούς δείκτες για βελτιωμένο εμπλουτισμό των CSC.

Τα κύτταρα πλευρικού πληθυσμού (SP) που αναγνωρίζονται από την εκροή της χρωστικής Hoechst 33342 αποτελούν έναν άλλο λειτουργικό δείκτη CSC. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν μεταφορείς κασέτας δέσμευσης ΑΤΡ που εκροφούν τη χρωστική που δεσμεύει το DNA, δημιουργώντας έναν διακριτό "πλευρικό" πληθυσμό στα διαγράμματα κυτταρομετρίας ροής. Τα κύτταρα SP επιδεικνύουν αυξημένη ικανότητα εκκίνησης όγκων και αντίσταση στη θεραπεία, με τη δραστηριότητα εκροής φαρμάκων να συμβάλλει ενδεχομένως στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία.

Η ικανότητα σχηματισμού σφαιρών σε μη προσκολλημένες συνθήκες, χωρίς ορό, παρέχει μια υποκατάστατη δοκιμασία για την αυτοανανέωση. Οι καλλιέργειες καρκινικών σφαιρών εμπλουτίζονται για κύτταρα που εκφράζουν δείκτες CSC και επιδεικνύουν αυξημένη καρκινικότητα. Η σειριακή διέλευση σφαιρών επιλέγει περαιτέρω τα αυτοανανεούμενα CSC και παρέχει ποσοτική αξιολόγηση της συχνότητας των βλαστικών κυττάρων μέσω της ανάλυσης οριακής αραίωσης.

Ειδικοί για τον όγκο δείκτες CSC

Τα βλαστικά κύτταρα των όγκων του εγκεφάλου αναγνωρίζονται από την έκφραση των CD133, nestin και Sox2, που αντικατοπτρίζουν τις ιδιότητες των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Το CD15 (SSEA-1) σηματοδοτεί ένα υποσύνολο βλαστικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος, ενώ το CD49f προσδιορίζει βλαστικά κύτταρα σε επιθετικά γλοιώματα. Η επικάλυψη μεταξύ των δεικτών νευρικών βλαστικών κυττάρων και των δεικτών CSC των όγκων του εγκεφάλου αντανακλά το δυνητικό κύτταρο προέλευσης αυτών των κακοηθειών.

Τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου εκφράζουν συνδυασμούς CD133, CD44 και EpCAM. Το Lgr5, ένα γονίδιο-στόχος του Wnt που σηματοδοτεί τα εντερικά βλαστικά κύτταρα, προσδιορίζει CSC στον καρκίνο του παχέος εντέρου με αυξημένη ικανότητα έναρξης όγκου. Η ταυτοποίηση των CSCs Lgr5⁺ υποδηλώνει ότι τα CSCs του παχέος εντέρου μπορεί να προκύψουν από φυσιολογικά εντερικά βλαστικά κύτταρα που αποκτούν ογκογόνες μεταλλάξεις.

Τα λευχαιμικά βλαστικά κύτταρα (LSC) στην οξεία μυελοειδή λευχαιμία (ΟΜΛ) βρίσκονται στον πληθυσμό CD34⁺CD38- που μοιάζει με τα φυσιολογικά αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα HL-60 παρέχουν μοντέλα οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας, ενώ τα κύτταρα K562 αντιπροσωπεύουν χρόνια μυελοειδή λευχαιμία με ιεραρχία που καθοδηγείται από την BCR-ABL. Τα κύτταρα Jurkat επιτρέπουν μελέτες CSC οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας Τ-κυττάρων.

Λειτουργική επικύρωση μέσω ξενομεταμόσχευσης

Το χρυσό πρότυπο για την επικύρωση των CSC είναι η έναρξη όγκου σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια. Οι δοκιμασίες μεταμόσχευσης με περιοριστική αραίωση ποσοτικοποιούν τη συχνότητα των κυττάρων που ξεκινούν τον όγκο σε πληθυσμούς που καθορίζονται από δείκτες. Τα εμπλουτισμένα με CSC κλάσματα εκκινούν όγκους σε χαμηλότερους αριθμούς κυττάρων από ό,τι τα κύτταρα του όγκου, αποδεικνύοντας αυξημένη ικανότητα εκκίνησης όγκων. Αυτή η διαφορά συχνότητας δημιουργεί λειτουργικές αποδείξεις για τον εμπλουτισμό των CSC από τους υποψήφιους δείκτες.

Η σειριακή μεταμόσχευση παρέχει στοιχεία για την ικανότητα αυτοανανέωσης. Οι όγκοι που εκκινούνται από πληθυσμούς CSC αναδιατάσσονται και μεταμοσχεύονται εκ νέου για να καταδειχθεί ότι τα CSC αναγεννώνται μόνα τους και αναδημιουργούν την ετερογένεια του όγκου. Η συνεχής έναρξη όγκων μέσω πολλαπλών γενεών μεταμόσχευσης επιβεβαιώνει τη μακροχρόνια αυτοανανέωση που διακρίνει τους πραγματικούς CSC από τους προγονικούς πληθυσμούς που πολλαπλασιάζονται κατά τη διέλευση.

Η ικανότητα διαφοροποίησης αξιολογείται με την απόδειξη ότι οι όγκοι που ξεκινούν από CSC περιέχουν κύτταρα που δεν έχουν δείκτες CSC. Η αποκατάσταση της φαινοτυπικής ετερογένειας από καθαρισμένους πληθυσμούς CSC επιβεβαιώνει την ικανότητα διαφοροποίησης. Η ανίχνευση της γραμμής με τη χρήση συστημάτων γενετικής σήμανσης παρέχει συμπληρωματικές αποδείξεις για τη διαφοροποίηση των CSC σε εγκατεστημένους όγκους.

Τεχνολογίες μεμονωμένων κυττάρων και ετερογένεια CSC

Η αλληλούχιση RNA ενός κυττάρου αποκαλύπτει μεταγραφική ετερογένεια εντός των πληθυσμών CSC, την οποία αποκρύπτει η μαζική ανάλυση. Η υπολογιστική ανάλυση τροχιάς προσδιορίζει μονοπάτια διαφοροποίησης και ενδιάμεσες καταστάσεις μεταξύ των CSC και των διαφοροποιημένων απογόνων. Αυτές οι αναλύσεις αποκαλύπτουν ότι οι καταστάσεις CSC υπάρχουν σε ένα συνεχές και όχι ως διακριτοί, σταθεροί φαινότυποι.

Η πλαστικότητα μεταξύ των καταστάσεων CSC και μη CSC αμφισβητεί τους ορισμούς των CSC που βασίζονται σε στατικούς δείκτες. Οι μη-CSC μπορούν να μετατραπούν σε CSC υπό κατάλληλες συνθήκες, συμπεριλαμβανομένων των σημάτων του μικροπεριβάλλοντος και του θεραπευτικού στρες. Αυτή η πλαστικότητα συνεπάγεται ότι η πλήρης εξάλειψη του όγκου μπορεί να απαιτεί την αντιμετώπιση τόσο των υφιστάμενων CSC όσο και των πιθανών πηγών αναγέννησης CSC.

Η χωρική μεταγραφομική εντοπίζει τις CSC εντός της αρχιτεκτονικής του όγκου, αποκαλύπτοντας την εξαρτώμενη από την εξειδικευμένη κατανομή των CSC. Οι περιαγγειακές κόγχες, οι υποξικές περιοχές και οι διεπιφάνειες όγκου-στρώματος φιλοξενούν πληθυσμούς CSC που επηρεάζονται από τοπικούς μικροπεριβαλλοντικούς παράγοντες. Η κατανόηση της συμβολής των εξειδικευμένων θέσεων στη διατήρηση των CSC παρέχει πληροφορίες για στρατηγικές διακοπής της υποστήριξης των CSC.

Δείκτες CSC και θεραπευτική αντίσταση

Οι πληθυσμοί CSC επιδεικνύουν αυξημένη αντίσταση στη συμβατική χημειοθεραπεία και ακτινοβολία μέσω πολλαπλών μηχανισμών, όπως η εκροή φαρμάκων, η ενισχυμένη επιδιόρθωση του DNA, η ηρεμία και η αντι-αποπτωτική σηματοδότηση. Οι πληθυσμοί με υψηλούς δείκτες CSC επιβιώνουν από την κυτταροτοξική θεραπεία και ενδεχομένως οδηγούν στην επανεμφάνιση του όγκου. Αυτή η αντίσταση στη θεραπεία παρέχει πρόσθετη λειτουργική επικύρωση της ταυτότητας των CSC.

Οι στοχευμένες θεραπείες κατά των δεικτών CSC ή των μονοπατιών εμπλουτισμένων με CSC στοχεύουν στην εξάλειψη των κυττάρων που ξεκινούν τον όγκο. Τα αντισώματα κατά του CD44, οι στοχευμένες προσεγγίσεις κατά του CD133 και οι αναστολείς της ALDH έχουν εισέλθει σε προκλινική και πρώιμη κλινική ανάπτυξη. Οι θεραπείες διαφοροποίησης που εξαναγκάζουν τα CSCs σε μη ογκογόνους φαινότυπους αντιπροσωπεύουν μια εναλλακτική στρατηγική.

Οι κυτταρικές σειρές συμπαγών όγκων παρέχουν μοντέλα για την έρευνα και την ανάπτυξη θεραπείας CSC. Τα κύτταρα HCT116 επιτρέπουν μελέτες CSC για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, ενώ τα κύτταρα A549 και τα κύτταρα NCI-H460 υποστηρίζουν την έρευνα CSC για τον καρκίνο του πνεύμονα. Τα κύτταρα U87MG παρέχουν μοντέλα CSC γλοιοβλαστώματος για μελέτες όγκων του εγκεφάλου.

Ποιοτικός έλεγχος και τυποποίηση

Τα τυποποιημένα πρωτόκολλα κυτταρομετρίας ροής διασφαλίζουν την αναπαραγωγική ανάλυση των δεικτών CSC. Συνεπείς κλώνοι αντισωμάτων, συζεύξεις φθοριοχρωμάτων και στρατηγικές πύλης επιτρέπουν τη σύγκριση μεταξύ μελετών. Η συμπερίληψη κατάλληλων ελέγχων, συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων ισοτύπου και των ελέγχων φθορισμού μείον ένα (FMO), εξασφαλίζει την ακριβή ταυτοποίηση των θετικών πληθυσμών δεικτών.

Η αυθεντικοποίηση κυτταρικής γραμμής επιβεβαιώνει την ταυτότητα της κυτταρικής γραμμής πριν από τις μελέτες δεικτών CSC. Η δοκιμή μυκοπλάσματος αποτρέπει τη μόλυνση που μεταβάλλει την έκφραση και τις λειτουργικές ιδιότητες των δεικτών CSC. Το μέσο κατάψυξης CM-1 επιτρέπει την αποθήκευση πληθυσμών εμπλουτισμένων με CSC για διαχρονικές μελέτες.

Συμπέρασμα

Η ταυτοποίηση δεικτών καρκινικών βλαστικών κυττάρων παραμένει απαραίτητη για την κατανόηση της ιεραρχίας του όγκου, την πρόβλεψη της θεραπευτικής ανταπόκρισης και την ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών για τα CSC. Ενώ έχουν προταθεί πολυάριθμοι δείκτες σε όλους τους τύπους όγκων, η αυστηρή λειτουργική επικύρωση μέσω μεταμόσχευσης με περιοριστική αραίωση, σειριακής διέλευσης και αξιολόγησης της διαφοροποίησης καθορίζει την πραγματική ταυτότητα των CSC. Οι τεχνολογίες μεμονωμένων κυττάρων αποκαλύπτουν την ετερογένεια και την πλαστικότητα των CSC που δεν είχαν εκτιμηθεί προηγουμένως, θέτοντας υπό αμφισβήτηση τους ορισμούς των CSC που βασίζονται σε στατικούς δείκτες. Η ενσωμάτωση της απομόνωσης βάσει δεικτών με λειτουργικό και μοριακό χαρακτηρισμό παρέχει την ολοκληρωμένη προσέγγιση που είναι απαραίτητη για τη μετάφραση της βιολογίας των CSC σε βελτιωμένη θεραπεία του καρκίνου.