Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Označevalci rakavih matičnih celic: Identifikacija in funkcionalna validacija

Hipoteza o rakavih matičnih celicah predlaga, da tumorji vsebujejo hierarhično organizirane populacije celic, pri čemer ima majhna podskupina celic lastnosti, podobne matičnim celicam, vključno s samoobnovitvijo, sposobnostjo diferenciacije in sposobnostjo sprožitve tumorja. Določitev označevalcev, ki zanesljivo ločijo CSC od večjih tumorskih celic, ima velik pomen za razumevanje biologije tumorjev, napovedovanje odpornosti na zdravljenje in razvoj terapij, ki so usmerjene v korenine rasti in ponovitve tumorja. Identifikacija in stroga funkcionalna potrditev označevalcev CSC sta še vedno bistvenega pomena za napredek tega področja v smeri klinične uporabe.

Ključne ugotovitve	Podrobnosti
Identifikacija površinskih označevalcev	Rakove matične celice se prepoznajo po površinskih označevalcih, ki omogočajo perspektivno izolacijo in funkcionalno karakterizacijo
Pogosti označevalci CSC	CD44, CD133, aktivnost ALDH in tkivno specifični označevalci, ki se razlikujejo glede na vrsto tumorja
Funkcionalno potrjevanje	Preskusi presaditve z omejitvijo razredčitve ugotavljajo sposobnost sprožitve tumorja
Kombinatorične strategije	Označevalci CSC lahko identificirajo prekrivajoče se, vendar različne populacije, ki zahtevajo kombinirane pristope z označevalci
Vpogled v posamezne celice	Enocelične tehnologije razkrivajo heterogenost in plastičnost CSC, kar je izziv za statične opredelitve označevalcev

Identifikacija CSC na podlagi površinskih markerjev

CD44 je eden od najbolj razširjenih označevalcev CSC v različnih vrstah tumorjev. Ta glikoprotein na površini celic deluje kot receptor za hialuronsko kislino ter sodeluje pri adheziji, migraciji in signalizaciji celic. Celice CD44⁺ imajo večjo tumorsko sposobnost pri raku dojk, glave in vratu, trebušne slinavke in drugih rakih. Variantne izoforme (CD44v), ki nastanejo z alternativnim spajanjem, v nekaterih okoliščinah dodatno razlikujejo populacije CSC.

CD133 (Prominin-1) je bil prvotno opredeljen kot označevalec krvotvornih matičnih celic, pozneje pa je bil prepoznan kot označevalec CSC v možganskih tumorjih, raku debelega črevesa in danke ter drugih malignomih. Celice CD133⁺ iz glioblastoma kažejo povečano samoobnovo, tvorbo nevrosfer in sposobnost sprožanja tumorjev. Vendar se lahko izražanje CD133 spreminja glede na pogoje gojenja in morda ne razlikuje univerzalno med CSC v vseh vrstah tumorjev.

Fenotip CD44⁺/CD24ˡᵒʷ- opredeljuje matične celice raka dojke z izboljšano tvorbo mamosfer in sposobnostjo sprožanja tumorjev v ksenograftih. Ta kombinacija označevalcev razlikuje CSC učinkoviteje kot kateri koli označevalec sam, kar ponazarja vrednost kombinatornih označevalnih strategij. Vendar se lahko fenotipi CSC med podtipi raka dojke razlikujejo, zato je potrebna validacija označevalcev, specifičnih za posamezen podtip.

Pristopi s funkcionalnimi označevalci

Aktivnost ALDH (aldehid dehidrogenaze), izmerjena s testom ALDEFLUOR, zagotavlja funkcionalni označevalec CSC, ki je neodvisen od fenotipa površine. Celice z ^visoko vsebnostjo ALDH izkazujejo večjo sposobnost sprožanja tumorjev, samoobnavljanja in odpornost na zdravljenje pri različnih vrstah raka, vključno z malignomi dojk, pljuč in hematološkimi malignomi. ALDH se kombinira s površinskimi označevalci za boljšo obogatitev CSC.

Celice stranske populacije (SP), prepoznane z odtekanjem barvila Hoechst 33342, so še en funkcionalni označevalec CSC. Te celice izražajo ATP-vezavne kasetne prenašalce, ki izločajo barvilo, ki se veže na DNK, in tako na diagramih pretočne citometrije ustvarijo ločeno "stransko" populacijo. Celice SP imajo večjo sposobnost sprožanja tumorjev in odpornost na zdravljenje, pri čemer lahko aktivnost iztekanja zdravil prispeva k odpornosti na kemoterapijo.

Sposobnost oblikovanja krogel v neadherentnih pogojih brez seruma zagotavlja nadomestni test za samoobnovo. Kulturi tumorskih sfer so obogatene s celicami, ki izražajo označevalce CSC in izkazujejo večjo tumorsko aktivnost. S serijskim podajanjem krogel se dodatno izbere samoobnavljajoče se CSC in zagotovi kvantitativno oceno pogostosti matičnih celic z analizo mejne razredčitve.

Za tumor specifični označevalci CSC

Izvorne celice možganskih tumorjev so prepoznane po izražanju CD133, nestina in Sox2, kar odraža lastnosti nevronskih matičnih celic. CD15 (SSEA-1) označuje podskupino matičnih celic glioblastoma, CD49f pa matičnim celicam podobne celice v agresivnih gliomih. Prekrivanje označevalcev nevronskih matičnih celic in označevalcev možganskih tumorjev CSC odraža potencialno izvorno celico teh malignomov.

Matične celice raka debelega črevesa izražajo kombinacije CD133, CD44 in EpCAM. Lgr5, tarčni gen Wnt, ki označuje črevesne matične celice, opredeljuje CSC pri kolorektalnem raku s povečano sposobnostjo sprožanja tumorjev. Identifikacija CSC Lgr5⁺ kaže, da lahko CSC debelega črevesa nastanejo iz normalnih črevesnih matičnih celic, ki pridobijo onkogene mutacije.

Leukemične matične celice (LSC) pri akutni mieloični levkemiji (AML) se nahajajo v populaciji CD34⁺CD38-, ki je podobna normalnim krvotvornim matičnim celicam. Celice HL-60 so model akutne promejelocitne levkemije, medtem ko celice K562 predstavljajo kronično mieloično levkemijo s hierarhijo, ki jo poganja BCR-ABL. Celice Jurkat omogočajo študije akutne limfoblastne levkemije T-celic CSC.

Funkcionalna validacija s ksenotransplantacijo

Zlati standard za potrjevanje CSC je sprožitev tumorja pri imunodeficientnih miših. S testi presaditve z omejeno razredčitvijo se določi pogostost celic, ki sprožijo tumor, v populacijah, opredeljenih z označevalci. Frakcije, obogatene s CSC, sprožijo tumorje pri manjšem številu celic kot tumorske celice, kar kaže na večjo sposobnost sprožanja tumorjev. Ta razlika v pogostosti je funkcionalni dokaz za obogatitev CSC s kandidati za označevalce.

Serijska presaditev zagotavlja dokaze o sposobnosti samoobnavljanja. Tumorji, ki so nastali iz populacij CSC, se ponovno razvrstijo in ponovno presadijo, da se dokaže, da se CSC obnavljajo in ponovno vzpostavijo heterogenost tumorja. Trajno sprožanje tumorjev z več generacijami presaditev potrjuje dolgoročno samoobnovo, ki razlikuje prave CSC od prehodnih progenitorjev.

Sposobnost diferenciacije je ocenjena z dokazom, da tumorji, ki jih sprožijo CSC, vsebujejo celice brez označevalcev CSC. Ponovna vzpostavitev fenotipske heterogenosti iz prečiščenih populacij CSC potrjuje sposobnost diferenciacije. Sledenje linij z uporabo genetskih označevalnih sistemov zagotavlja dopolnilne dokaze za diferenciacijo CSC v ustaljenih tumorjih.

Enocelične tehnologije in heterogenost CSC

Sekvenciranje RNK v eni celici razkrije transkriptomsko heterogenost znotraj populacij CSC, ki jo analiza v velikem obsegu prikriva. Računalniška analiza trajektorij identificira poti diferenciacije in vmesna stanja med CSC in diferenciranimi potomci. Te analize razkrivajo, da stanja CSC obstajajo v kontinuumu in ne kot diskretni, stabilni fenotipi.

Plastičnost med stanji CSC in ne-CSC postavlja pod vprašaj statične opredelitve CSC, ki temeljijo na označevalcih. Ne-CSC se lahko pod ustreznimi pogoji, vključno z mikrookoljskimi signali in terapevtskim stresom, spremenijo v CSC. Ta plastičnost pomeni, da je za popolno izkoreninjenje tumorja morda treba obravnavati tako obstoječe CSC kot tudi morebitne vire regeneracije CSC.

Prostorska transkriptomika locira CSC znotraj strukture tumorja in razkriva porazdelitev CSC, ki je odvisna od niše. Perivaskularne niše, hipoksična območja in vmesniki med tumorjem in stromajem so prostor za populacije CSC, na katere vplivajo lokalni mikrookoljski dejavniki. Razumevanje prispevka niš k vzdrževanju CSC je podlaga za strategije za prekinitev podpore CSC.

Označevalci CSC in odpornost na zdravljenje

Populacije CSC so bolj odporne na konvencionalno kemoterapijo in obsevanje z več mehanizmi, vključno z iztekanjem zdravil, izboljšanim popravljanjem DNK, mirovanjem in anti-apoptotično signalizacijo. Populacije CSC z visoko vsebnostjo označevalcev preživijo citotoksično zdravljenje in lahko povzročijo ponovitev tumorja. Ta odpornost na zdravljenje zagotavlja dodatno funkcionalno potrditev identitete CSC.

Cilj ciljno usmerjene terapije proti označevalcem CSC ali potem, obogatenim s CSC, so namenjene odstranitvi celic, ki sprožijo tumor. V predkliničnem in zgodnjem kliničnem razvoju so bila uvedena protitelesa proti CD44, pristopi, usmerjeni na CD133, in zaviralci ALDH. Alternativna strategija so diferenciacijske terapije, ki silijo CSC v netumorogene fenotipe.

Celične linije trdnih tumorjev so modeli za raziskave CSC in razvoj terapij. Celice HCT116 omogočajo študije CSC kolorektalnega raka, medtem ko celice A549 in celice NCI-H460 podpirajo raziskave CSC pljučnega raka. Celice U87MG zagotavljajo modele glioblastoma CSC za študije možganskih tumorjev.

Nadzor kakovosti in standardizacija

Standardizirani protokoli pretočne citometrije zagotavljajo ponovljivo analizo označevalcev CSC. Dosledni kloni protiteles, konjugati fluorohromov in strategije zapornic omogočajo primerjavo med študijami. Vključitev ustreznih kontrol, vključno s kontrolami izotipov in kontrolami fluorescence minus ena (FMO), zagotavlja natančno identifikacijo populacij, pozitivnih na označevalce.

Preverjanje pristnosti celičnih linij potrjuje istovetnost celičnih linij pred študijami označevalcev CSC. Testiranje mikoplazme preprečuje kontaminacijo, ki spreminja izražanje in funkcionalne lastnosti označevalcev CSC. Sredstvo za zamrzovanje CM-1 omogoča shranjevanje populacij, obogatenih s CSC, za longitudinalne študije.

Zaključek

Identifikacija označevalcev rakavih matičnih celic je še vedno bistvena za razumevanje hierarhije tumorjev, napovedovanje odziva na zdravljenje in razvoj terapij, usmerjenih v CSC. Medtem ko so bili predlagani številni označevalci v različnih vrstah tumorjev, je treba za ugotavljanje prave identitete CSC uporabiti strogo funkcionalno validacijo s presaditvijo z omejeno razredčitvijo, serijsko presaditvijo in oceno diferenciacije. Enocelične tehnologije razkrivajo prej neprecenjeno heterogenost in plastičnost CSC, kar je izziv za statične opredelitve CSC, ki temeljijo na označevalcih. Integracija izolacije na podlagi označevalcev s funkcionalno in molekularno karakterizacijo zagotavlja celovit pristop, ki je potreben za prenos biologije CSC v izboljšano zdravljenje raka.