Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

ตัวบ่งชี้เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง: การระบุและการตรวจสอบการทำงาน

สมมติฐานเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) เสนอว่าเนื้องอกประกอบด้วยประชากรเซลล์ที่มีการจัดระเบียบเป็นลำดับชั้น โดยมีกลุ่มเซลล์ขนาดเล็กที่มีคุณสมบัติคล้ายเซลล์ต้นกำเนิด ซึ่งรวมถึงการสามารถแบ่งตัวเพื่อสร้างเซลล์ใหม่ การเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดต่าง ๆ และความสามารถในการก่อให้เกิดเนื้องอกใหม่การระบุตัวบ่งชี้ที่สามารถแยกแยะเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSCs) ได้อย่างน่าเชื่อถือจากเซลล์เนื้องอกทั่วไป มีผลกระทบอย่างลึกซึ้งต่อการทำความเข้าใจชีววิทยาของเนื้องอก การทำนายการดื้อต่อการรักษา และการพัฒนาวิธีการรักษาที่มุ่งเป้าไปที่ต้นตอของการเจริญเติบโตและการกลับมาเป็นซ้ำของเนื้องอก การระบุและการตรวจสอบการทำงานอย่างเข้มงวดของตัวบ่งชี้ CSC ยังคงเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการพัฒนาด้านนี้ไปสู่การประยุกต์ใช้ทางคลินิก

ประเด็นสำคัญ	รายละเอียด
การระบุเครื่องหมายบนพื้นผิว	เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งสามารถระบุได้ด้วยตัวบ่งชี้บนผิวเซลล์ ซึ่งช่วยให้สามารถแยกและวิเคราะห์ลักษณะการทำงานได้
ตัวบ่งชี้ CSC ทั่วไป	CD44, CD133, กิจกรรมของ ALDH และตัวบ่งชี้เฉพาะของเนื้อเยื่อที่แตกต่างกันตามชนิดของเนื้องอก
การตรวจสอบการทำงาน	การทดสอบการปลูกถ่ายด้วยการเจือจางจำกัดเพื่อประเมินความสามารถในการก่อกำเนิดเนื้องอก
กลยุทธ์เชิงผสมผสาน	เครื่องหมาย CSC อาจระบุประชากรที่ทับซ้อนกันแต่แยกจากกันซึ่งต้องการวิธีการใช้เครื่องหมายแบบผสมผสาน
ข้อมูลเชิงลึกจากเซลล์เดี่ยว	เทคโนโลยีเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความหลากหลายและความยืดหยุ่นของเซลล์ต้นกำเนิดชนิดเฉพาะ (CSC) ซึ่งเป็นความท้าทายต่อการกำหนดตัวบ่งชี้แบบคงที่

การระบุตัวตนของ CSC โดยใช้เครื่องหมายบนผิว

CD44 เป็นหนึ่งในตัวบ่งชี้ CSC ที่ถูกใช้อย่างแพร่หลายที่สุดในหลากหลายชนิดของเนื้องอก โปรตีนไกลโคโปรตีนบนผิวเซลล์นี้ทำหน้าที่เป็นตัวรับสำหรับกรดไฮยาลูโรนิคและมีส่วนร่วมในการยึดติดของเซลล์ การเคลื่อนที่ และการส่งสัญญาณ เซลล์ CD44⁺ แสดงความสามารถในการก่อเนื้องอกที่เพิ่มขึ้นในมะเร็งเต้านม มะเร็งศีรษะและคอ มะเร็งตับอ่อน และมะเร็งชนิดอื่นๆไอโซฟอร์มตัวแปร (CD44v) ที่เกิดขึ้นจากการสลับลำดับเบสทางเลือกช่วยแยกแยะประชากรของเซลล์ต้นกำเนิดชนิดเฉพาะ (CSC) ในบางบริบทได้ดียิ่งขึ้น

CD133 (Prominin-1) ถูกระบุครั้งแรกเป็นเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด และต่อมาได้รับการยอมรับว่าเป็นเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งในเนื้องอกสมอง มะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก และมะเร็งชนิดอื่นๆเซลล์ CD133⁺ จากเนื้องอกสมองชนิดกลีโอบลาสโตมาแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มจำนวนตัวเอง การสร้างนิวโรสเฟียร์ และความสามารถในการก่อให้เกิดเนื้องอก อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ CD133 อาจแตกต่างกันไปตามสภาวะการเพาะเลี้ยง และอาจไม่สามารถแยกแยะเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอก (CSCs) ได้ในทุกชนิดของเนื้องอก

ฟีโนไทป์ CD44⁺/CD24ˡᵒʷ⁻ สามารถระบุเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเต้านมที่มีการสร้างแมมโมสเฟียร์เพิ่มขึ้นและความสามารถในการก่อให้เกิดเนื้องอกในหนูทดลองได้ การรวมเครื่องหมายนี้สามารถแยกแยะเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งได้ดีกว่าการใช้เครื่องหมายใดเครื่องหมายหนึ่งเพียงอย่างเดียว ซึ่งแสดงให้เห็นถึงคุณค่าของกลยุทธ์การใช้เครื่องหมายร่วมกัน อย่างไรก็ตาม ฟีโนไทป์ของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งอาจแตกต่างกันระหว่างชนิดย่อยของมะเร็งเต้านม ซึ่งจำเป็นต้องมีการตรวจสอบความถูกต้องของเครื่องหมายเฉพาะชนิดย่อย

วิธีการใช้เครื่องหมายเชิงหน้าที่

กิจกรรมของ ALDH (aldehyde dehydrogenase) ที่วัดโดยวิธี ALDEFLUOR ให้ตัวบ่งชี้ CSC ที่ทำงานได้โดยไม่ขึ้นกับลักษณะพื้นผิวของเซลล์ เซลล์^{ที่มี ALDH สูง}แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการก่อเนื้องอก การสร้างตัวเองใหม่ และการต้านทานการรักษาที่เพิ่มขึ้นในมะเร็งหลายชนิด รวมถึงมะเร็งเต้านม มะเร็งปอด และมะเร็งทางโลหิตวิทยา ALDH รวมกับตัวบ่งชี้พื้นผิวเพื่อเพิ่มความเข้มข้นของ CSC

เซลล์ประชากรข้าง (Side population หรือ SP) ที่ถูกระบุโดยการขับสารย้อม Hoechst 33342 ออกจากเซลล์ ถือเป็นเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดชนิดพิเศษ (CSC) อีกประเภทหนึ่ง เซลล์เหล่านี้แสดงออกของโปรตีนขนส่งกลุ่ม ATP-binding cassette ซึ่งทำหน้าที่ขับสารย้อมที่จับกับดีเอ็นเอ ส่งผลให้เกิดประชากร "ข้าง" ที่แยกออกจากกันบนกราฟโฟลไซโตเมทรี เซลล์ SP แสดงความสามารถในการก่อเนื้องอกใหม่และต้านทานการรักษาที่สูงขึ้น โดยกิจกรรมการขับยาออกจากเซลล์อาจมีส่วนทำให้เกิดการดื้อต่อเคมีบำบัด

ความสามารถในการสร้างทรงกลมในสภาวะที่ไม่เกาะติดและปราศจากซีรั่มให้ผลการทดสอบที่ใช้แทนการทดสอบการเกิดใหม่ของเซลล์เอง การเพาะเลี้ยงทูเมอร์สเฟียร์ช่วยเพิ่มจำนวนเซลล์ที่แสดงเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) และแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการก่อเนื้องอกที่เพิ่มขึ้น การผ่านสเฟียร์เป็นลำดับช่วยคัดเลือกเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งที่สามารถเกิดใหม่ได้มากขึ้น และให้การประเมินเชิงปริมาณของความถี่ของเซลล์ต้นกำเนิดผ่านการวิเคราะห์การเจือจางจำกัด

ตัวบ่งชี้ CSC เฉพาะของเนื้องอก

เซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอกในสมองสามารถระบุได้จาก CD133, nestin, และ Sox2 ซึ่งสะท้อนคุณสมบัติของเซลล์ต้นกำเนิดประสาท CD15 (SSEA-1) เป็นเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอกในสมองชนิด glioblastoma บางกลุ่ม ในขณะที่ CD49f ระบุเซลล์ที่มีลักษณะคล้ายต้นกำเนิดในเนื้องอกในสมองชนิดรุนแรง การทับซ้อนกันระหว่างเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดประสาทและเครื่องหมายของเซลล์ต้นกำเนิดของเนื้องอกในสมองสะท้อนถึงความเป็นไปได้ของเซลล์ต้นกำเนิดของมะเร็งชนิดนี้

เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักแสดงออกถึง CD133, CD44, และ EpCAM ร่วมกัน Lgr5 ซึ่งเป็นยีนเป้าหมายของ Wnt ที่ทำเครื่องหมายเซลล์ต้นกำเนิดในลำไส้ สามารถระบุ CSCs ในมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักที่มีความสามารถในการก่อให้เกิดเนื้องอกเพิ่มขึ้น การระบุ Lgr5⁺ CSCs ชี้ให้เห็นว่า CSCs ในลำไส้ใหญ่และทวารหนักอาจเกิดขึ้นจากเซลล์ต้นกำเนิดในลำไส้ปกติที่ได้รับกลายพันธุ์ที่ทำให้เกิดมะเร็ง

เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาว (LSCs) ในโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันชนิดไมอีลอยด์ (AML) อยู่ภายในประชากร CD34⁺CD38⁻ ซึ่งมีลักษณะคล้ายกับเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดปกติเซลล์ HL-60ให้แบบจำลองของโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันแบบพรอมีอีโลไซต์ในขณะที่เซลล์ K562เป็นตัวแทนของโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเรื้อรังแบบไมอีลอยด์ที่มีลำดับชั้นขับเคลื่อนโดย BCR-ABLเซลล์ Jurkatช่วยให้สามารถศึกษาเซลล์ต้นกำเนิดของโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันของเซลล์ที (T-cell acute lymphoblastic leukaemia)

การตรวจสอบการทำงานผ่านการปลูกถ่ายอวัยวะระหว่างสายพันธุ์

มาตรฐานทองคำสำหรับการตรวจสอบความถูกต้องของ CSC คือการเริ่มต้นของเนื้องอกในหนูที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง การทดสอบการปลูกถ่ายแบบเจือจางจำกัดปริมาณจะวัดความถี่ของเซลล์เริ่มต้นเนื้องอกภายในประชากรที่กำหนดด้วยเครื่องหมาย CSC ส่วนที่มี CSC สูงจะเริ่มต้นเนื้องอกที่จำนวนเซลล์น้อยกว่าเซลล์เนื้องอกทั่วไป ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการเริ่มต้นเนื้องอกที่เพิ่มขึ้น ความแตกต่างของความถี่นี้สร้างหลักฐานเชิงหน้าที่สำหรับการเพิ่มความเข้มข้นของ CSC โดยเครื่องหมายที่เป็นผู้สมัคร

การปลูกถ่ายแบบต่อเนื่องให้หลักฐานเกี่ยวกับความสามารถในการสร้างตัวเองใหม่ของเซลล์ มะเร็งที่เริ่มต้นจากประชากร CSC จะถูกคัดแยกและปลูกถ่ายใหม่เพื่อแสดงให้เห็นว่า CSC สามารถสร้างตัวเองใหม่และฟื้นฟูความหลากหลายของมะเร็งได้ การเริ่มต้นมะเร็งอย่างต่อเนื่องผ่านการปลูกถ่ายหลายรุ่นยืนยันความสามารถในการสร้างตัวเองใหม่ในระยะยาว ซึ่งแยก CSC ที่แท้จริงออกจากเซลล์ต้นกำเนิดที่ขยายตัวชั่วคราว

ความสามารถในการเปลี่ยนแปลงสามารถประเมินได้โดยการแสดงให้เห็นว่าเนื้องอกที่เกิดจาก CSC มีเซลล์ที่ขาดเครื่องหมายของ CSC การสร้างลักษณะทางฟีโนไทป์ที่หลากหลายขึ้นใหม่จากประชากร CSC ที่บริสุทธิ์ยืนยันความสามารถในการเปลี่ยนแปลง การติดตามสายพันธุ์โดยใช้ระบบการทำเครื่องหมายทางพันธุกรรมให้หลักฐานเสริมสำหรับการเปลี่ยนแปลงของ CSC ในเนื้องอกที่ก่อตัวแล้ว

เทคโนโลยีเซลล์เดี่ยวและความไม่สม่ำเสมอของเซลล์ต้นกำเนิดชนิดเฉพาะ

การวิเคราะห์ RNA ของเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความหลากหลายของทรานสคริปโตมภายในประชากร CSC ซึ่งการวิเคราะห์แบบกลุ่มไม่สามารถมองเห็นได้ การวิเคราะห์เส้นทางเชิงคำนวณระบุเส้นทางการเปลี่ยนแปลงและสถานะระหว่างกลางระหว่าง CSC และเซลล์ลูกหลานที่เปลี่ยนแปลงแล้ว การวิเคราะห์เหล่านี้เผยให้เห็นว่าสถานะของ CSC อยู่ในรูปแบบต่อเนื่องมากกว่าที่จะเป็นฟีโนไทป์ที่แยกจากกันและคงที่

ความยืดหยุ่นระหว่างสถานะ CSC และสถานะที่ไม่ใช่ CSC ท้าทายการนิยาม CSC ที่ใช้เครื่องหมายคงที่ CSC ที่ไม่ใช่ CSC สามารถเปลี่ยนเป็น CSC ได้ภายใต้เงื่อนไขที่เหมาะสม รวมถึงสัญญาณจากสิ่งแวดล้อมรอบเซลล์และความเครียดจากการรักษา ความยืดหยุ่นนี้บ่งชี้ว่าการกำจัดเนื้องอกอย่างสมบูรณ์อาจจำเป็นต้องจัดการทั้ง CSC ที่มีอยู่และแหล่งกำเนิดที่อาจเกิดขึ้นของ CSC

การวิเคราะห์ทรานสคริปโตมิคส์เชิงพื้นที่สามารถระบุตำแหน่งของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSCs) ภายในโครงสร้างของเนื้องอก เผยให้เห็นการกระจายตัวของ CSCs ที่ขึ้นอยู่กับนิชเฉพาะ นิชรอบหลอดเลือด บริเวณที่มีออกซิเจนต่ำ และรอยต่อระหว่างเนื้องอกกับเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน เป็นที่อยู่อาศัยของประชากร CSCs ที่ได้รับอิทธิพลจากปัจจัยแวดล้อมในบริเวณนั้น การเข้าใจบทบาทของนิชต่อการคงอยู่ของ CSCs ช่วยให้สามารถพัฒนากลยุทธ์ในการทำลายการสนับสนุนของ CSCs ได้

เครื่องหมาย CSC และความต้านทานต่อการรักษา

ประชากรเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) แสดงความต้านทานที่เพิ่มขึ้นต่อเคมีบำบัดแบบดั้งเดิมและการฉายรังสีผ่านกลไกหลายประการ รวมถึงการขับยาออก การซ่อมแซมดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้น การหยุดการแบ่งเซลล์ และการส่งสัญญาณต้านการตายของเซลล์ การประชากรที่มีตัวบ่งชี้ CSC สูงจะรอดชีวิตจากการบำบัดด้วยยาที่มีพิษต่อเซลล์และมีศักยภาพในการกระตุ้นการกลับมาเป็นซ้ำของเนื้องอก ความต้านทานต่อการบำบัดนี้ให้การยืนยันเชิงหน้าที่เพิ่มเติมเกี่ยวกับเอกลักษณ์ของ CSC

การบำบัดแบบมุ่งเป้าต่อตัวบ่งชี้ CSC หรือเส้นทางที่อุดมด้วย CSC มีเป้าหมายเพื่อกำจัดเซลล์เริ่มต้นของเนื้องอก แอนติบอดีต่อต้าน CD44 วิธีการที่มุ่งเป้า CD133 และสารยับยั้ง ALDH ได้เข้าสู่ระยะก่อนคลินิกและการพัฒนาทางคลินิกในระยะเริ่มต้น การบำบัดด้วยการเปลี่ยนแปลงเซลล์ที่บังคับให้ CSC เปลี่ยนไปเป็นลักษณะที่ไม่ก่อให้เกิดเนื้องอกถือเป็นกลยุทธ์ทางเลือก

เซลล์ไลน์ของเนื้องอกชนิดแข็งให้แบบจำลองสำหรับการวิจัย CSC และการพัฒนาการรักษาHCT116 Cellsช่วยให้การศึกษา CSC ของมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนักเป็นไปได้ ในขณะที่A549 CellsและNCI-H460 Cellsสนับสนุนการวิจัย CSC ของมะเร็งปอดU87MG Cellsให้แบบจำลอง CSC ของ glioblastoma สำหรับการศึกษาเนื้องอกในสมอง

การควบคุมคุณภาพและการมาตรฐาน

โปรโตคอลการวิเคราะห์เซลล์ด้วยวิธีโฟลไซโตเมทรีที่ได้มาตรฐานช่วยให้การวิเคราะห์ตัวบ่งชี้เซลล์ต้นกำเนิด (CSC) มีความแม่นยำและสามารถทำซ้ำได้ การใช้โคลนแอนติบอดีที่สม่ำเสมอ คอนจูเกตฟลูออโรโครม และกลยุทธ์การเกตติ้งที่เหมือนกัน ช่วยให้สามารถเปรียบเทียบผลการศึกษาระหว่างกันได้ การควบคุมคุณภาพที่เหมาะสม รวมถึงการควบคุมชนิดไอโซไทป์ (isotype control) และการควบคุมแบบฟลูออเรสเซนซ์ลบหนึ่ง (FMO control) ช่วยให้สามารถระบุประชากรที่มีตัวบ่งชี้บวกได้อย่างถูกต้อง

การยืนยันสายเซลล์ยืนยันตัวตนของสายเซลล์ก่อนการศึกษาเครื่องหมาย CSCการทดสอบไมโคพลาสมาป้องกันการปนเปื้อนที่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของเครื่องหมาย CSC และคุณสมบัติการทำงานสารละลายแช่แข็ง CM-1ช่วยให้สามารถเก็บรักษาประชากรที่อุดมด้วย CSC สำหรับการศึกษาในระยะยาว

สรุป

การระบุตัวบ่งชี้เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งยังคงมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการทำความเข้าใจลำดับชั้นของเนื้องอก การทำนายการตอบสนองต่อการรักษา และการพัฒนาวิธีการรักษาที่มุ่งเป้าไปที่เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) แม้ว่าจะมีตัวบ่งชี้จำนวนมากที่ถูกเสนอในเนื้องอกหลายชนิด แต่การตรวจสอบการทำงานอย่างเข้มงวดผ่านการปลูกถ่ายแบบเจือจางจำกัด การผ่านรุ่นต่อเนื่อง และการประเมินการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ชนิดอื่นเท่านั้นที่สามารถยืนยันตัวตนที่แท้จริงของ CSC ได้เทคโนโลยีเซลล์เดี่ยวเผยให้เห็นความหลากหลายและความยืดหยุ่นของเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็ง (CSC) ที่ไม่เคยถูกเข้าใจมาก่อน ซึ่งท้าทายต่อการนิยาม CSC แบบคงที่ที่ใช้เครื่องหมายเป็นตัวบ่งชี้ การบูรณาการการแยกเซลล์โดยใช้เครื่องหมายร่วมกับลักษณะทางหน้าที่และระดับโมเลกุลให้แนวทางที่ครอบคลุมซึ่งจำเป็นสำหรับการแปลชีววิทยาของ CSC ไปสู่การรักษาโรคมะเร็งที่มีประสิทธิภาพยิ่งขึ้น