Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Các dấu hiệu của tế bào gốc ung thư: Xác định và xác nhận chức năng

Giả thuyết về tế bào gốc ung thư (CSC) cho rằng khối u chứa các quần thể tế bào được tổ chức theo cấp bậc, trong đó một nhóm nhỏ tế bào có các đặc tính tương tự tế bào gốc, bao gồm khả năng tự tái tạo, khả năng biệt hóa và khả năng khởi phát khối u. Việc xác định các dấu hiệu có thể phân biệt đáng tin cậy giữa CSC và các tế bào khối u thông thường có ý nghĩa sâu sắc trong việc hiểu rõ sinh học khối u, dự đoán kháng trị liệu và phát triển các liệu pháp nhắm vào gốc rễ của sự phát triển và tái phát khối u. Việc xác định và xác nhận chức năng nghiêm ngặt của các dấu hiệu CSC vẫn là yếu tố thiết yếu để thúc đẩy lĩnh vực này tiến tới ứng dụng lâm sàng.

Điểm chính	Chi tiết
Xác định dấu hiệu bề mặt	Tế bào gốc ung thư được xác định bằng các dấu hiệu bề mặt cho phép tách biệt và đặc trưng chức năng một cách có hệ thống
Các dấu hiệu CSC phổ biến	CD44, CD133, hoạt động ALDH và các dấu hiệu đặc hiệu mô tùy thuộc vào loại khối u
Xác minh chức năng	Thử nghiệm cấy ghép pha loãng giới hạn xác định khả năng khởi phát khối u
Chiến lược kết hợp	Các dấu hiệu CSC có thể xác định các quần thể trùng lặp nhưng riêng biệt, đòi hỏi các phương pháp kết hợp dấu hiệu
Nhận thức về tế bào đơn lẻ	Công nghệ tế bào đơn lẻ tiết lộ sự đa dạng và tính linh hoạt của CSC, thách thức các định nghĩa dấu hiệu tĩnh

Xác định tế bào gốc ung thư (CSC) dựa trên dấu hiệu bề mặt

CD44 là một trong những dấu hiệu CSC được sử dụng rộng rãi nhất trên nhiều loại khối u khác nhau. Protein glycoprotein bề mặt này hoạt động như một thụ thể cho axit hyaluronic và tham gia vào quá trình bám dính, di chuyển và truyền tín hiệu của tế bào. Các tế bào CD44⁺ thể hiện khả năng gây ung thư cao hơn trong các loại ung thư vú, đầu cổ, tụy và các loại ung thư khác. Các dạng biến thể (CD44v) được tạo ra bởi quá trình cắt nối thay thế giúp phân biệt các quần thể CSC trong một số trường hợp.

CD133 (Prominin-1) ban đầu được xác định là dấu hiệu của tế bào gốc tạo máu và sau đó được công nhận là dấu hiệu của CSC trong các khối u não, ung thư đại trực tràng và các loại ung thư khác. Các tế bào CD133⁺ từ u não đa hình (glioblastoma) có khả năng tự tái tạo, hình thành neurosphere và khởi phát khối u cao hơn. Tuy nhiên, biểu hiện CD133 có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy và có thể không phân biệt được CSCs trên tất cả các loại khối u.

Phänotype CD44⁺/CD24ˡᵒʷ⁻ xác định các tế bào gốc ung thư vú có khả năng hình thành mammosphere và khởi phát khối u trong mô hình xenograft tăng cường. Sự kết hợp này phân biệt CSCs hiệu quả hơn so với từng dấu hiệu riêng lẻ, minh họa giá trị của chiến lược dấu hiệu kết hợp. Tuy nhiên, các đặc điểm của CSCs có thể thay đổi giữa các loại ung thư vú khác nhau, đòi hỏi việc xác nhận dấu hiệu cụ thể cho từng loại.

Các phương pháp dấu hiệu chức năng

Hoạt động ALDH (aldehyde dehydrogenase) được đo bằng thử nghiệm ALDEFLUOR cung cấp một dấu hiệu chức năng của CSC độc lập với kiểu hình bề mặt. Các tế bào^ALDHhigh thể hiện khả năng khởi phát khối u, tự tái tạo và kháng trị liệu tăng cường trên nhiều loại ung thư bao gồm ung thư vú, phổi và các bệnh huyết học. ALDH kết hợp với các dấu hiệu bề mặt để cải thiện việc phân lập CSC.

Tế bào dân số bên (SP) được xác định bằng cách thải trừ thuốc nhuộm Hoechst 33342 đại diện cho một dấu hiệu chức năng khác của CSC. Các tế bào này biểu hiện các vận chuyển ATP-binding cassette (ABC) thải trừ thuốc nhuộm liên kết DNA, tạo ra một dân số "bên" riêng biệt trên đồ thị phân tích dòng chảy. Tế bào SP thể hiện khả năng khởi phát khối u và kháng trị liệu tăng cường, với hoạt động thải trừ thuốc có thể góp phần vào kháng hóa trị.

Khả năng tạo khối cầu trong điều kiện không bám dính, không có huyết thanh cung cấp một phương pháp thay thế để đánh giá khả năng tự tái tạo. Văn hóa khối cầu giàu các tế bào biểu hiện dấu hiệu CSC và có khả năng gây ung thư tăng cường. Việc truyền khối cầu liên tiếp tiếp tục chọn lọc các CSC tự tái tạo và cung cấp đánh giá định lượng tần suất tế bào gốc thông qua phân tích pha loãng giới hạn.

Dấu hiệu CSC đặc hiệu khối u

Tế bào gốc ung thư não được xác định bằng biểu hiện CD133, nestin và Sox2, phản ánh đặc tính của tế bào gốc thần kinh. CD15 (SSEA-1) đánh dấu một nhóm tế bào gốc glioblastoma, trong khi CD49f xác định các tế bào có đặc tính gốc trong glioma ác tính. Sự trùng lặp giữa các dấu hiệu của tế bào gốc thần kinh và dấu hiệu CSC của ung thư não phản ánh nguồn gốc tiềm năng của các khối u này.

Tế bào gốc ung thư đại trực tràng biểu hiện các kết hợp CD133, CD44 và EpCAM. Lgr5, một gen mục tiêu của Wnt đánh dấu tế bào gốc ruột, xác định CSC trong ung thư đại trực tràng với khả năng khởi phát khối u tăng cường. Việc xác định CSC Lgr5⁺ gợi ý rằng CSC đại trực tràng có thể phát sinh từ tế bào gốc ruột bình thường thu được các đột biến gây ung thư.

Tế bào gốc ung thư bạch cầu (LSCs) trong ung thư bạch cầu cấp tính dòng tủy (AML) tồn tại trong quần thể CD34⁺CD38⁻, tương tự như tế bào gốc tạo máu bình thường. Tế bào HL-60 cung cấp mô hình ung thư bạch cầu cấp tính thể tiền tủy bào, trong khi tế bào K562 đại diện cho ung thư bạch cầu tủy mạn tính với cấu trúc phân cấp do BCR-ABL điều khiển. Tế bào Jurkat cho phép nghiên cứu tế bào gốc ung thư trong ung thư bạch cầu lympho cấp tính thể T.

Xác minh chức năng thông qua cấy ghép xenotransplantation

Tiêu chuẩn vàng để xác nhận CSC là khả năng khởi phát khối u trong chuột thiếu miễn dịch. Các thử nghiệm cấy ghép pha loãng giới hạn định lượng tần suất của các tế bào khởi phát khối u trong các quần thể được xác định bằng dấu hiệu. Các phân đoạn giàu CSC khởi phát khối u ở số lượng tế bào thấp hơn so với các tế bào khối u thông thường, chứng minh khả năng khởi phát khối u được tăng cường. Sự khác biệt về tần suất này cung cấp bằng chứng chức năng cho việc làm giàu CSC bằng các dấu hiệu ứng viên.

Cấy ghép liên tiếp cung cấp bằng chứng về khả năng tự tái tạo. Các khối u được khởi phát từ các quần thể CSC được phân loại lại và cấy ghép lại để chứng minh rằng CSC tự tái tạo và tái tạo sự đa dạng của khối u. Khả năng khởi phát khối u liên tục qua nhiều thế hệ cấy ghép xác nhận khả năng tự tái tạo lâu dài, phân biệt CSC thật với các tiền thân tăng sinh tạm thời.

Khả năng biệt hóa được đánh giá bằng cách chứng minh rằng các khối u khởi phát từ CSC chứa các tế bào thiếu các dấu hiệu CSC. Việc tái tạo tính đa dạng hình thái từ các quần thể CSC tinh khiết xác nhận khả năng biệt hóa. Theo dõi dòng tế bào bằng các hệ thống đánh dấu di truyền cung cấp bằng chứng bổ sung cho quá trình biệt hóa của CSC trong các khối u đã hình thành.

Công nghệ phân tích tế bào đơn lẻ và tính đa dạng của tế bào gốc ung thư (CSC)

Phân tích trình tự RNA đơn bào cho thấy sự đa dạng về biểu hiện gen trong các quần thể tế bào gốc ung thư (CSC), điều mà phân tích tổng hợp không thể phát hiện. Phân tích đường dẫn tính toán xác định các con đường biệt hóa và trạng thái trung gian giữa CSC và các tế bào con đã biệt hóa. Các phân tích này cho thấy trạng thái của CSC tồn tại trên một phổ liên tục chứ không phải là các biểu hiện ổn định, riêng biệt.

Sự linh hoạt giữa các trạng thái CSC và không-CSC thách thức các định nghĩa tĩnh dựa trên dấu hiệu của CSC. Các tế bào không-CSC có thể chuyển đổi thành CSC dưới các điều kiện thích hợp, bao gồm tín hiệu vi môi trường và stress điều trị. Sự linh hoạt này ngụ ý rằng việc loại bỏ hoàn toàn khối u có thể yêu cầu giải quyết cả các CSC hiện có và các nguồn tiềm năng tái tạo CSC.

Phân tích transcriptomics không gian xác định vị trí của CSC trong cấu trúc khối u, tiết lộ sự phân bố của CSC phụ thuộc vào niche. Các niche quanh mạch máu, vùng thiếu oxy và giao diện khối u-stroma chứa các quần thể CSC bị ảnh hưởng bởi các yếu tố vi môi trường địa phương. Hiểu rõ đóng góp của niche vào việc duy trì CSC cung cấp cơ sở cho các chiến lược phá vỡ sự hỗ trợ cho CSC.

Các dấu hiệu CSC và kháng trị liệu

Các quần thể CSC thể hiện khả năng kháng thuốc cao đối với hóa trị và xạ trị thông qua nhiều cơ chế, bao gồm thải thuốc, sửa chữa DNA tăng cường, trạng thái nghỉ ngơi và tín hiệu chống apoptosis. Các quần thể CSC có dấu hiệu cao sống sót sau điều trị độc tế bào và có thể thúc đẩy tái phát khối u. Kháng thuốc này cung cấp bằng chứng chức năng bổ sung cho bản chất của CSC.

Các liệu pháp nhắm mục tiêu vào dấu hiệu CSC hoặc các con đường giàu CSC nhằm loại bỏ các tế bào khởi phát khối u. Các kháng thể chống CD44, các phương pháp nhắm mục tiêu CD133 và các chất ức chế ALDH đã bước vào giai đoạn phát triển tiền lâm sàng và lâm sàng sớm. Các liệu pháp phân hóa ép CSC chuyển sang các biểu hiện không gây ung thư đại diện cho một chiến lược thay thế.

Các dòng tế bào khối u rắn cung cấp mô hình cho nghiên cứu CSC và phát triển liệu pháp. Tế bào HCT116 cho phép nghiên cứu CSC trong ung thư đại trực tràng, trong khi tế bào A549 và NCI-H460 hỗ trợ nghiên cứu CSC trong ung thư phổi. Tế bào U87MG cung cấp mô hình CSC cho nghiên cứu u não.

Kiểm soát chất lượng và tiêu chuẩn hóa

Các quy trình phân tích dòng chảy tế bào tiêu chuẩn hóa đảm bảo phân tích dấu hiệu CSC có thể tái hiện. Các dòng kháng thể nhất quán, các phức hợp fluorochrome và các chiến lược phân loại cho phép so sánh giữa các nghiên cứu. Việc bao gồm các mẫu đối chứng phù hợp, bao gồm các mẫu đối chứng isotype và các mẫu đối chứng fluorescence minus one (FMO), đảm bảo xác định chính xác các quần thể có dấu hiệu dương tính.

Xác thực dòng tế bào xác nhận danh tính của dòng tế bào trước khi tiến hành nghiên cứu dấu hiệu CSC. Kiểm tra mycoplasma ngăn ngừa nhiễm khuẩn làm thay đổi biểu hiện dấu hiệu CSC và tính chất chức năng. Dung dịch đông lạnh CM-1 cho phép lưu trữ các quần thể giàu CSC cho các nghiên cứu theo dõi dài hạn.

Kết luận

Xác định dấu hiệu tế bào gốc ung thư vẫn là yếu tố thiết yếu để hiểu cấu trúc phân cấp khối u, dự đoán phản ứng điều trị và phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu vào CSC. Mặc dù nhiều dấu hiệu đã được đề xuất trên các loại khối u khác nhau, việc xác nhận chức năng nghiêm ngặt thông qua cấy ghép pha loãng giới hạn, truyền qua nhiều lần và đánh giá phân hóa mới xác định được bản chất thực sự của CSC. Công nghệ tế bào đơn lẻ tiết lộ sự đa dạng và tính linh hoạt của CSC chưa được đánh giá cao trước đây, thách thức các định nghĩa tĩnh dựa trên dấu hiệu về CSC. Việc tích hợp phân lập dựa trên dấu hiệu với đặc trưng chức năng và phân tử cung cấp phương pháp toàn diện cần thiết để chuyển đổi sinh học CSC thành các phương pháp điều trị ung thư cải tiến.