Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Marcadores de células estaminais cancerígenas: Identificação e validação funcional

A hipótese das células estaminais cancerígenas (CSC) propõe que os tumores contêm populações de células organizadas hierarquicamente, com um pequeno subconjunto de células que possuem propriedades semelhantes às das células estaminais, incluindo auto-renovação, capacidade de diferenciação e capacidade de iniciação de tumores. A identificação de marcadores que distingam de forma fiável as CSC das células tumorais em massa tem profundas implicações para a compreensão da biologia dos tumores, para a previsão da resistência aos tratamentos e para o desenvolvimento de terapias que visem a raiz do crescimento e da recorrência dos tumores. A identificação e a validação funcional rigorosa dos marcadores de CSC continuam a ser essenciais para o avanço deste domínio em direção à aplicação clínica.

Principais conclusões	Detalhes
Identificação de marcadores de superfície	As células estaminais cancerígenas são identificadas por marcadores de superfície que permitem o isolamento prospetivo e a caraterização funcional
Marcadores comuns de CSC	CD44, CD133, atividade ALDH e marcadores específicos de tecidos que variam consoante o tipo de tumor
Validação funcional	Os ensaios de transplantação com diluição limitante estabelecem a capacidade de iniciação do tumor
Estratégias combinatórias	Os marcadores de CSC podem identificar populações sobrepostas mas distintas, exigindo abordagens combinatórias de marcadores
Percepções de célula única	As tecnologias de célula única revelam a heterogeneidade e a plasticidade das CSC, pondo em causa as definições de marcadores estáticos

Identificação de CSC com base em marcadores de superfície

O CD44 representa um dos marcadores de CSC mais amplamente utilizados em diversos tipos de tumores. Esta glicoproteína de superfície celular funciona como um recetor para o ácido hialurónico e participa na adesão, migração e sinalização celular. As células CD44⁺ demonstram uma maior capacidade tumorigénica em cancros da mama, da cabeça e do pescoço, do pâncreas e outros. As isoformas variantes (CD44v) geradas por splicing alternativo distinguem ainda mais as populações de CSC em alguns contextos.

O CD133 (Prominin-1) foi inicialmente identificado como um marcador de células estaminais hematopoiéticas e subsequentemente reconhecido como marcador de CSC em tumores cerebrais, cancro colorrectal e outras doenças malignas. As células CD133⁺ do glioblastoma demonstram uma maior auto-renovação, formação de neurosferas e capacidade de iniciação de tumores. No entanto, a expressão de CD133 pode variar consoante as condições de cultura e pode não distinguir universalmente as CSC em todos os tipos de tumores.

O fenótipo CD44⁺/CD24ˡᵒʷ- identifica as células estaminais do cancro da mama com maior formação de mammosferas e capacidade de iniciação de tumores em xenoenxertos. Esta combinação de marcadores distingue as CSC de forma mais eficaz do que qualquer um dos marcadores isoladamente, ilustrando o valor das estratégias combinatórias de marcadores. No entanto, os fenótipos das CSC podem variar entre subtipos de cancro da mama, exigindo a validação de marcadores específicos para cada subtipo.

Abordagens de marcadores funcionais

A atividade da ALDH (aldeído desidrogenase) medida pelo ensaio ALDEFLUOR fornece um marcador funcional de CSC independente do fenótipo de superfície. As células com ALDH ^elevado demonstram uma maior capacidade de iniciação de tumores, auto-renovação e resistência à terapia em vários tipos de cancro, incluindo da mama, do pulmão e malignidades hematológicas. A ALDH combina-se com marcadores de superfície para um melhor enriquecimento das CSC.

As células da população lateral (SP) identificadas pelo efluxo do corante Hoechst 33342 representam outro marcador funcional de CSC. Estas células expressam transportadores de cassetes de ligação ATP que efluem o corante de ligação ao ADN, criando uma população "lateral" distinta nos gráficos de citometria de fluxo. As células SP demonstram uma maior capacidade de iniciação de tumores e resistência à terapêutica, com a atividade de efluxo de fármacos a contribuir potencialmente para a resistência à quimioterapia.

A capacidade de formação de esferas em condições não aderentes e sem soro fornece um ensaio substituto para a auto-renovação. As culturas de esferas tumorais enriquecem as células que expressam marcadores de CSC e demonstram uma maior tumorigenicidade. A passagem em série de esferas seleciona ainda mais as CSC auto-renováveis e fornece uma avaliação quantitativa da frequência das células estaminais através da análise de diluição limitante.

Marcadores de CSC específicos do tumor

As células estaminais dos tumores cerebrais são identificadas pela expressão de CD133, nestina e Sox2, reflectindo as propriedades das células estaminais neurais. O CD15 (SSEA-1) marca um subconjunto de células estaminais do glioblastoma, enquanto o CD49f identifica células estaminais em gliomas agressivos. A sobreposição entre marcadores de células estaminais neurais e marcadores de CSC de tumores cerebrais reflecte a potencial célula de origem destes tumores malignos.

As células estaminais do cancro colorrectal expressam combinações de CD133, CD44 e EpCAM. O Lgr5, um gene alvo da Wnt que marca as células estaminais intestinais, identifica as CSC no cancro colorrectal com maior capacidade de iniciação de tumores. A identificação de CSCs Lgr5⁺ sugere que as CSCs colorrectais podem surgir a partir de células estaminais intestinais normais que adquirem mutações oncogénicas.

As células estaminais leucémicas (LSC) na leucemia mieloide aguda (LMA) residem na população CD34⁺CD38-, assemelhando-se às células estaminais hematopoiéticas normais. As células HL-60 proporcionam modelos de leucemia promielocítica aguda, enquanto as células K562 representam a leucemia mieloide crónica com hierarquia orientada para BCR-ABL. As células Jurkat permitem estudos de CSC de leucemia linfoblástica aguda de células T.

Validação funcional através de xenotransplantação

O padrão de ouro para a validação das CSC é o início do tumor em ratinhos imunodeficientes. Os ensaios de transplantação com diluição limitante quantificam a frequência de células iniciadoras de tumores em populações definidas por marcadores. As fracções enriquecidas de CSC iniciam tumores com um número de células inferior ao das células tumorais em massa, demonstrando uma maior capacidade de iniciação de tumores. Esta diferença de frequência estabelece provas funcionais do enriquecimento das CSC por marcadores candidatos.

O transplante em série fornece provas da capacidade de auto-renovação. Os tumores iniciados a partir de populações de CSC são novamente selecionados e retransplantados para demonstrar que as CSC se regeneram a si próprias e reconstituem a heterogeneidade do tumor. A iniciação sustentada de tumores através de múltiplas gerações de transplantes confirma a auto-renovação a longo prazo, distinguindo as verdadeiras CSC dos progenitores de amplificação em trânsito.

A capacidade de diferenciação é avaliada através da demonstração de que os tumores iniciados por CSC contêm células que não possuem marcadores de CSC. A reconstituição da heterogeneidade fenotípica a partir de populações purificadas de CSC confirma a capacidade de diferenciação. O rastreio de linhagens utilizando sistemas de marcação genética fornece provas complementares da diferenciação das CSC em tumores estabelecidos.

Tecnologias de célula única e heterogeneidade das CSC

A sequenciação de ARN de célula única revela a heterogeneidade transcriptómica nas populações de CSC que a análise em massa oculta. A análise computacional da trajetória identifica caminhos de diferenciação e estados intermédios entre as CSC e a descendência diferenciada. Estas análises revelam que os estados das CSC existem num continuum e não como fenótipos discretos e estáveis.

A plasticidade entre estados de CSC e não-CSC desafia as definições de CSC baseadas em marcadores estáticos. As células não-CSC podem converter-se em células CSC em condições adequadas, incluindo sinais microambientais e stress terapêutico. Esta plasticidade implica que a erradicação completa do tumor pode exigir a abordagem tanto das CSC existentes como de potenciais fontes de regeneração de CSC.

A transcriptómica espacial localiza as CSC na arquitetura do tumor, revelando uma distribuição das CSC dependente do nicho. Os nichos perivasculares, as regiões hipóxicas e as interfaces tumor-estroma albergam populações de CSC influenciadas por factores microambientais locais. A compreensão das contribuições dos nichos para a manutenção das CSC permite definir estratégias para interromper o apoio às CSC.

Marcadores de CSC e resistência terapêutica

As populações de CSC demonstram uma maior resistência à quimioterapia convencional e à radiação através de múltiplos mecanismos, incluindo o efluxo de fármacos, a melhoria da reparação do ADN, a quiescência e a sinalização anti-apoptótica. As populações com marcadores elevados de CSC sobrevivem à terapêutica citotóxica e podem conduzir à recorrência do tumor. Esta resistência à terapia fornece uma validação funcional adicional para a identidade das CSC.

As terapias direcionadas contra marcadores de CSC ou vias enriquecidas por CSC têm como objetivo eliminar as células iniciadoras de tumores. Os anticorpos anti-CD44, as abordagens direcionadas para o CD133 e os inibidores da ALDH entraram em desenvolvimento pré-clínico e clínico inicial. As terapias de diferenciação que forçam as CSC a atingir fenótipos não tumorigénicos representam uma estratégia alternativa.

As linhas celulares de tumores sólidos fornecem modelos para a investigação das CSC e o desenvolvimento de terapias. As células HCT116 permitem o estudo das CSC do cancro colorrectal, enquanto as células A549 e as células NCI-H460 apoiam a investigação das CSC do cancro do pulmão. As células U87MG fornecem modelos de CSC de glioblastoma para estudos de tumores cerebrais.

Controlo de qualidade e normalização

Os protocolos normalizados de citometria de fluxo garantem uma análise reprodutível dos marcadores de CSC. Clones de anticorpos, conjugados de fluorocromos e estratégias de gating consistentes permitem a comparação entre estudos. A inclusão de controlos adequados, incluindo controlos de isótipos e controlos de fluorescência menos um (FMO), garante a identificação exacta de populações positivas para os marcadores.

A autenticação da linha celular confirma a identidade da linha celular antes dos estudos de marcadores de CSC. O teste de micoplasma evita a contaminação que altera a expressão e as propriedades funcionais dos marcadores de CSC. O Freeze Medium CM-1 permite o armazenamento de populações enriquecidas com CSC para estudos longitudinais.

Conclusão

A identificação de marcadores de células estaminais cancerígenas continua a ser essencial para compreender a hierarquia dos tumores, prever a resposta ao tratamento e desenvolver terapias direcionadas para as CSC. Embora tenham sido propostos numerosos marcadores em todos os tipos de tumores, uma validação funcional rigorosa através de transplante de diluição limitante, passagem em série e avaliação da diferenciação estabelece a verdadeira identidade das CSC. As tecnologias de célula única revelam uma heterogeneidade e plasticidade das CSC anteriormente não apreciadas, pondo em causa as definições estáticas de CSC baseadas em marcadores. A integração do isolamento baseado em marcadores com a caraterização funcional e molecular proporciona a abordagem abrangente necessária para traduzir a biologia das CSC num melhor tratamento do cancro.