Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Маркери за ракови стволови клетки: Идентифициране и функционално валидиране

Хипотезата за раковите стволови клетки (РСК) предполага, че туморите съдържат йерархично организирани клетъчни популации, като малка подгрупа от клетки притежава свойства, подобни на стволовите, включително самообновяване, способност за диференциране и способност за иницииране на тумори. Идентифицирането на маркери, които надеждно разграничават CSC от туморните клетки в по-голямата им част, има огромно значение за разбирането на туморната биология, прогнозирането на резистентността към лечение и разработването на терапии, насочени към корена на туморния растеж и рецидивите. Идентифицирането и стриктното функционално валидиране на CSC маркери остава от съществено значение за напредъка на тази област към клинично приложение.

Основни изводи	Подробности
Идентифициране на повърхностни маркери	Раковите стволови клетки се идентифицират чрез повърхностни маркери, което позволява перспективно изолиране и функционално характеризиране
Често срещани маркери на CSC	CD44, CD133, активност на ALDH и тъканно-специфични маркери, вариращи според вида на тумора
Функционално валидиране	Тестове за трансплантация с ограничаване на разреждането установяват способността за иницииране на тумори
Комбинативни стратегии	Маркерите на CSC могат да идентифицират припокриващи се, но различни популации, изискващи комбинаторни подходи за маркери
Прозрения за една клетка	Единичните клетъчни технологии разкриват хетерогенност и пластичност на CSC, които са предизвикателство за статичните определения на маркерите

Идентифициране на CSC на базата на повърхностни маркери

CD44 е един от най-широко използваните маркери за CSC при различни видове тумори. Този гликопротеин на клетъчната повърхност функционира като рецептор за хиалуронова киселина и участва в клетъчната адхезия, миграция и сигнализация. CD44⁺ клетките демонстрират повишена туморогенност при рак на гърдата, главата и шията, панкреаса и други видове рак. Вариативни изоформи (CD44v), генерирани чрез алтернативен сплайсинг, допълнително разграничават популациите на CSC в някои контексти.

CD133 (Prominin-1) първоначално е идентифициран като маркер за хемопоетични стволови клетки, а впоследствие е признат за маркер на CSCs при мозъчни тумори, колоректален рак и други злокачествени заболявания. CD133⁺ клетките от глиобластом демонстрират засилено самообновяване, образуване на невросфери и способност за иницииране на тумори. Експресията на CD133 обаче може да варира в зависимост от условията на култивиране и може да не позволява универсално разграничаване на CSC във всички видове тумори.

Фенотипът CD44⁺/CD24ˡᵒʷ- идентифицира стволовите клетки на рака на гърдата с повишено образуване на мамосфери и капацитет за иницииране на тумори при ксенографт. Тази комбинация от маркери разграничава CSCs по-ефективно, отколкото всеки един от маркерите поотделно, което илюстрира стойността на комбинаторните стратегии за маркери. Въпреки това фенотиповете на CSC могат да се различават между подтиповете на рака на гърдата, което изисква валидиране на специфични за подтипа маркери.

Подходи за функционални маркери

Активността на ALDH (алдехиддехидрогеназа), измерена чрез теста ALDEFLUOR, осигурява функционален CSC маркер, независим от фенотипа на повърхността. Клетките с високо ^{съдържание} на ALDH демонстрират повишена способност за иницииране на тумори, самообновяване и резистентност към терапия при различни видове рак, включително рак на гърдата, белия дроб и хематологични злокачествени заболявания. ALDH се комбинира с повърхностни маркери за подобрено обогатяване на CSC.

Клетките от страничната популация (SP), идентифицирани чрез изтичане на багрилото Hoechst 33342, представляват друг функционален маркер за CSC. Тези клетки експресират АТФ-свързващи касетъчни транспортери, които изхвърлят ДНК-свързващото багрило, като създават отделна "странична" популация на диаграмите на поточната цитометрия. SP клетките демонстрират повишена способност за иницииране на тумори и резистентност към терапия, като активността на лекарствения ефлукс потенциално допринася за резистентността към химиотерапия.

Капацитетът за образуване на сфери в неадхерентни условия без серум осигурява заместител на теста за самообновяване. Културите с туморсфери се обогатяват с клетки, експресиращи маркери на CSC и демонстриращи повишена туморогенност. Серийното пасиране на сфери допълнително селектира самообновяващи се CSC и осигурява количествена оценка на честотата на стволовите клетки чрез анализ на ограничаващото разреждане.

Специфични за тумора маркери на CSC

Стволовите клетки на мозъчните тумори се идентифицират по експресията на CD133, nestin и Sox2, което отразява свойствата на невронните стволови клетки. CD15 (SSEA-1) маркира подгрупа стволови клетки на глиобластома, докато CD49f идентифицира стволови клетки в агресивни глиоми. Припокриването между маркерите на невронните стволови клетки и маркерите на CSC на мозъчните тумори отразява потенциалната клетка на произход за тези злокачествени заболявания.

Стволовите клетки на колоректалния рак експресират комбинации от CD133, CD44 и EpCAM. Lgr5, ген-мишена на Wnt, маркиращ чревните стволови клетки, идентифицира CSC в колоректалния рак с повишена способност за иницииране на тумори. Идентифицирането на Lgr5⁺ CSCs предполага, че колоректалните CSCs могат да възникнат от нормални чревни стволови клетки, които придобиват онкогенни мутации.

Левкемичните стволови клетки (LSCs) при острата миелоидна левкемия (AML) се намират в популацията CD34⁺CD38-, наподобяваща нормалните хемопоетични стволови клетки. Клетките HL-60 представляват модели на остра промиелоцитна левкемия, докато клетките K562 представляват хронична миелоидна левкемия с йерархия, управлявана от BCR-ABL. Клетките Jurkat дават възможност за изследвания на CSC при остра лимфобластна левкемия с Т-клетки.

Функционално валидиране чрез ксенотрансплантация

Златен стандарт за валидиране на CSC е инициирането на тумор в имунодефицитни мишки. Изследванията за трансплантация с ограничено разреждане определят количествено честотата на туморните клетки в рамките на популации, определени по маркери. Обогатените фракции на CSC инициират тумори при по-нисък брой клетки, отколкото основните туморни клетки, което показва повишен капацитет за иницииране на тумори. Тази разлика в честотата създава функционално доказателство за обогатяването на CSC чрез кандидат-маркери.

Серийната трансплантация предоставя доказателства за способността за самообновяване. Туморите, инициирани от популации на CSC, се сортират и трансплантират отново, за да се докаже, че CSC се самовъзстановяват и възстановяват туморната хетерогенност. Устойчивото иницииране на тумори чрез многобройни поколения трансплантации потвърждава дългосрочното самообновяване, което разграничава истинските CSC от транзитно амплифициращите се прогенитори.

Способността за диференциране се оценява, като се доказва, че инициираните от ЦСК тумори съдържат клетки, при които липсват маркери за ЦСК. Възстановяването на фенотипна хетерогенност от пречистени популации от КСК потвърждава капацитета за диференциране. Проследяването на линиите с помощта на генетични системи за маркиране предоставя допълнителни доказателства за диференциацията на CSC в установени тумори.

Едноклетъчни технологии и хетерогенност на CSC

Едноклетъчното секвениране на РНК разкрива транскриптомна хетерогенност в популациите на CSC, която се засенчва от масовия анализ. Компютърният анализ на траекторията идентифицира пътищата на диференциация и междинните състояния между CSC и диференцираното потомство. Тези анализи разкриват, че състоянията на CSC съществуват по-скоро в континуум, отколкото като дискретни, стабилни фенотипове.

Пластичността между състоянията на ЦСК и не-ЦСК поставя под въпрос статичните определения на ЦСК, основани на маркери. Не-CSCs могат да се превърнат в CSCs при подходящи условия, включително сигнали от микросредата и терапевтичен стрес. Тази пластичност предполага, че пълното изкореняване на тумора може да изисква да се обърне внимание както на съществуващите CSCs, така и на потенциалните източници на регенерация на CSCs.

Пространствената транскриптомика локализира CSCs в рамките на туморната архитектура, разкривайки зависимо от нишата разпределение на CSCs. Периваскуларните ниши, хипоксичните области и интерфейсите между тумора и ствола приютяват популации от ЦСК, повлияни от местните фактори на микросредата. Разбирането на приноса на нишите за поддържането на КСК дава информация за стратегии за прекъсване на подкрепата на КСК.

CSC маркери и терапевтична резистентност

Популациите от CSC демонстрират повишена резистентност към конвенционалната химиотерапия и радиация чрез множество механизми, включително изтичане на лекарства, подобрена ДНК репарация, спокойствие и антиапоптотична сигнализация. Популациите с високо съдържание на CSC маркери оцеляват след цитотоксична терапия и потенциално могат да предизвикат рецидив на тумора. Тази резистентност към терапия осигурява допълнително функционално потвърждение на идентичността на CSC.

Целенасочените терапии срещу маркерите на CSC или обогатените с тях пътища имат за цел да елиминират иницииращите тумора клетки. Анти-CD44 антитела, CD133-таргетирани подходи и ALDH инхибитори са в процес на предклинично и ранно клинично разработване. Алтернативна стратегия представляват терапиите за диференциация, които принуждават CSC към нетуморогенни фенотипи.

Клетъчните линии на солидни тумори предоставят модели за изследване на CSC и разработване на терапии. Клетките HCT116 дават възможност за изследване на CSC при колоректален рак, докато клетките A549 и NCI-H460 подпомагат изследването на CSC при рак на белия дроб. Клетките U87MG предоставят модели на глиобластомни CSC за изследвания на мозъчни тумори.

Контрол на качеството и стандартизация

Стандартизираните протоколи за поточна цитометрия осигуряват възпроизводим анализ на маркерите на CSC. Последователни клонове на антитела, флуорохромни конюгати и стратегии за заграждане позволяват сравняване на различни изследвания. Включването на подходящи контроли, включително изотипни контроли и флуоресцентни контроли минус едно (FMO), гарантира точното идентифициране на популациите с положителни маркери.

Удостоверяването на клетъчната линия потвърждава идентичността на клетъчната линия преди изследванията на маркерите на CSC. Тестването за микоплазма предотвратява замърсяване, което променя експресията и функционалните свойства на CSC маркерите. Замразяващата среда CM-1 дава възможност за съхраняване на обогатени с CSC популации за надлъжни проучвания.

Заключение

Идентифицирането на маркери на ракови стволови клетки остава от съществено значение за разбирането на йерархията на тумора, прогнозирането на отговора на лечението и разработването на терапии, насочени към CSC. Въпреки че са предложени многобройни маркери за различни видове тумори, строгото функционално валидиране чрез трансплантация в ограничаващо разреждане, серийно пасиране и оценка на диференциацията установява истинската идентичност на ЦСК. Единичните клетъчни технологии разкриват неподозирани досега хетерогенност и пластичност на ЦСК, като поставят под въпрос статичните дефиниции на ЦСК, основани на маркери. Интегрирането на изолирането на базата на маркери с функционално и молекулярно характеризиране осигурява всеобхватния подход, необходим за превръщането на биологията на CSC в подобрено лечение на рака.