Cancer Stem Cell Markers: Identification and Functional Validation

Vēža cilmes šūnu marķieri: Identifikācija un funkcionālā validācija

Vēža cilmes šūnu (CSC) hipotēze paredz, ka audzēji satur hierarhiski organizētas šūnu populācijas ar nelielu šūnu apakšgrupu, kurai piemīt cilmes šūnām līdzīgas īpašības, tostarp pašatjaunošanās, diferenciācijas spēja un audzēju ierosināšanas spēja. Pazīmju noteikšanai, kas ļauj droši atšķirt CSC no lielākās audzēja šūnu daļas, ir liela nozīme audzēju bioloģijas izpratnē, rezistences pret ārstēšanu prognozēšanā un terapijas izstrādē, kas vērsta uz audzēju augšanas un atkārtošanās cēloņiem. CSC marķieru identificēšana un stingra funkcionālā validācija joprojām ir būtiska, lai virzītu šo jomu uz klīnisko pielietojumu.

Galvenais secinājums	Sīkāka informācija
Virsmas marķieru identifikācija	Vēža cilmes šūnas identificē pēc virsmas marķieriem, kas ļauj veikt to izolāciju un funkcionālo raksturojumu
Biežāk sastopamie CSC marķieri	CD44, CD133, ALDH aktivitāte un audu specifiskie marķieri, kas atšķiras atkarībā no audzēja veida
Funkcionālā validācija	Ierobežojoša atšķaidījuma transplantācijas testi, ar kuriem nosaka audzēju ierosinošās spējas
Kombinētās stratēģijas	CSC marķieri var identificēt pārklājošas, bet atšķirīgas populācijas, kam nepieciešamas kombinētas marķieru pieejas
Vienas šūnas ieskats	Vienšūnu tehnoloģijas atklāj CSC heterogenitāti un plastiskumu, kas apgrūtina statisko marķieru definīcijas

Uz virsmas marķieriem balstīta CSC identifikācija

CD44 ir viens no visplašāk izmantotajiem CSC marķieriem dažādos audzēju veidos. Šis šūnu virsmas glikoproteīns darbojas kā hialuronskābes receptoru un piedalās šūnu adhēzijas, migrācijas un signalizācijas procesos. CD44⁺ šūnas uzrāda pastiprinātu audzēja spēju krūts, galvas un kakla, aizkuņģa dziedzera un citu vēža veidu audzējos. Dažos kontekstos CSC populācijas vēl vairāk atšķiras ar alternatīvās sajaukšanas rezultātā radītām izoformām (CD44v).

CD133 (Prominīns-1) sākotnēji tika identificēts kā hematopoētisko cilmes šūnu marķieris, bet vēlāk tika atzīts par CSC marķieri smadzeņu audzēju, kolorektālā vēža un citu ļaundabīgu audzēju gadījumā. CD133⁺ šūnas no glioblastomas uzrāda pastiprinātu pašatjaunošanās spēju, neirosfēru veidošanos un audzēju ierosināšanas spēju. Tomēr CD133 ekspresija var atšķirties atkarībā no kultūras apstākļiem, un tā var nešķirt CSC visos audzēju tipos.

CD44⁺/CD24ˡᵒʷ- fenotips identificē krūts vēža cilmes šūnas ar pastiprinātu mammosfēras veidošanos un ksenogrāfa audzēju ierosināšanas spēju. Šī marķieru kombinācija ļauj atšķirt CSC efektīvāk nekā jebkurš no šiem marķieriem atsevišķi, tādējādi ilustrējot kombinēto marķieru stratēģiju vērtību. Tomēr CSC fenotipi var atšķirties dažādos krūts vēža apakštipos, tāpēc ir nepieciešama apakštipa specifisku marķieru validācija.

Funkcionālo marķieru pieejas

ALDH (aldehīda dehidrogenāzes) aktivitāte, ko mēra ar ALDEFLUOR testu, nodrošina funkcionālu CSC marķieri neatkarīgi no virsmas fenotipa. Šūnas ar augstu ^ALDH saturu uzrāda paaugstinātu audzēju ierosināšanas spēju, pašatjaunošanos un rezistenci pret terapiju dažādos vēža veidos, tostarp krūts, plaušu un hematoloģiskos ļaundabīgos audzējos. ALDH apvienojas ar virsmas marķieriem, lai uzlabotu CSC bagātināšanu.

Vēl viens funkcionāls CSC marķieris ir sānu populācijas (SP) šūnas, ko identificē pēc Hoechst 33342 krāsas izplūdes. Šīs šūnas ekspresē ATP saistošās kasetes transportierus, kas izplūdina DNS saistošo krāsvielu, plūsmas citometrijas diagrammās veidojot atšķirīgu "sānu" populāciju. SP šūnas uzrāda paaugstinātu audzēja ierosināšanas spēju un rezistenci pret terapiju, un zāļu izplūdes aktivitāte, iespējams, veicina rezistenci pret ķīmijterapiju.

Spēja veidot sfēras neadherentos apstākļos bez seruma nodrošina pašatjaunošanās aizstājējvērtību. Audzējsfēru kultūras bagātinās ar šūnām, kas ekspresē CSC marķierus un uzrāda pastiprinātu audzēja aktivitāti. Sērijveida lodīšu pasāža vēl vairāk atlasa pašatjaunojošās CSC un nodrošina cilmes šūnu biežuma kvantitatīvu novērtēšanu, izmantojot ierobežojošā atšķaidījuma analīzi.

Audzējam specifiski CSC marķieri

Smadzeņu audzēju cilmes šūnas identificē pēc CD133, nestīna un Sox2 ekspresijas, kas atspoguļo nervu cilmes šūnu īpašības. CD15 (SSEA-1) iezīmē glioblastomas cilmes šūnu apakšgrupu, savukārt CD49f identificē cilmes šūnas agresīvās gliomās. Neironu cilmes šūnu marķieru un smadzeņu audzēju CSC marķieru pārklāšanās atspoguļo šo ļaundabīgo audzēju potenciālo izcelsmes šūnu.

Kolorektālā vēža cilmes šūnas pauž CD133, CD44 un EpCAM kombinācijas. Lgr5, Wnt mērķa gēns, kas iezīmē zarnu cilmes šūnas, identificē CSC kolorektālā vēža gadījumā ar paaugstinātu audzēju ierosināšanas spēju. Lgr5⁺ CSC identificēšana liecina, ka kolorektālās zarnas CSC var rasties no normālām zarnu cilmes šūnām, kas iegūst onkogēnas mutācijas.

Akūtas mieloīdās leikēmijas (AML) leikēmijas cilmes šūnas (LSC) atrodas CD34⁺CD38- populācijā, kas atgādina normālas hematopoētiskās cilmes šūnas. HL-60 šūnas ir akūtas promielocitiskās leikēmijas modeļi, savukārt K562 šūnas pārstāv hronisku mieloīdu leikēmiju ar BCR-ABL vadītu hierarhiju. Jurkat šūnas ļauj veikt T-šūnu akūtas limfoblastiskās leikēmijas CSC pētījumus.

Funkcionālā validācija, izmantojot ksenotransplantāciju

CSC validācijas zelta standarts ir audzēja ierosināšana imūndeficītām pelēm. Ierobežotas atšķaidīšanas transplantācijas testos kvantitatīvi nosaka audzēju ierosinošo šūnu biežumu marķieriem definētās populācijās. Ar CSC bagātinātas frakcijas ierosina audzējus ar mazāku šūnu skaitu nekā lielākās audzēja šūnas, kas liecina par palielinātu audzēju ierosināšanas spēju. Šī biežuma atšķirība ir funkcionāls pierādījums CSC bagātināšanai ar kandidātmarķieriem.

Sērijveida transplantācija sniedz pierādījumus par pašatjaunošanās spēju. No CSC populācijām iniciēti audzēji tiek pāršķiroti un atkārtoti transplantēti, lai pierādītu, ka CSC reģenerējas un atjauno audzēju heterogenitāti. Ilgstoša audzēju iniciācija vairākās transplantācijas paaudzēs apstiprina ilgtermiņa pašatjaunošanos, kas ļauj atšķirt īstos CSC no tranzītamplicējošiem progenitoriem.

Diferenciācijas spēja tiek novērtēta, pierādot, ka CSC iniciētos audzējos ir šūnas, kurām trūkst CSC marķieru. Fenotipiskās heterogenitātes atjaunošana no attīrītām CSC populācijām apstiprina diferenciācijas spēju. Līniju izsekošana, izmantojot ģenētiskās marķēšanas sistēmas, sniedz papildu pierādījumus par CSC diferenciāciju izveidotos audzējos.

Vienas šūnas tehnoloģijas un CSC heterogenitāte

Vienas šūnas RNS sekvenēšana atklāj transkriptomisko heterogenitāti CSC populācijās, kas nav redzama masveida analīzē. Datoriskā trajektoriju analīze identificē diferenciācijas ceļus un starpstāvokļus starp CSC un diferencētiem pēcnācējiem. Šīs analīzes atklāj, ka CSC stāvokļi pastāv nepārtraukti, nevis kā diskrēti, stabili fenotipi.

Plastiskums starp CSC un ne-CSC stāvokļiem apšauba uz statiskiem marķieriem balstītas CSC definīcijas. Ne-CSCs var pārveidoties par CSCs atbilstošos apstākļos, ieskaitot mikrovides signālus un terapeitisko stresu. Šī plastiskums nozīmē, ka pilnīgai audzēja izskaušanai var būt nepieciešama gan esošo CSC, gan potenciālo CSC reģenerācijas avotu novēršana.

Telpiskā transkriptomika lokalizē CSCs audzēja arhitektūrā, atklājot no nišas atkarīgu CSC izplatību. Perivaskulārās nišas, hipoksiskie reģioni un audzēja un audzēja un audzēja-troma saskarnes ir mājvieta CSC populācijām, ko ietekmē vietējie mikrovides faktori. Izpratne par nišu ietekmi uz CSC uzturēšanu palīdz izstrādāt stratēģijas, lai pārtrauktu CSC atbalstu.

CSC marķieri un terapeitiskā rezistence

CSC populācijas uzrāda pastiprinātu rezistenci pret parasto ķīmijterapiju un apstarošanu, izmantojot vairākus mehānismus, tostarp zāļu izplūdi, pastiprinātu DNS atjaunošanu, klusumu un anti-apoptozes signalizāciju. CSC populācijas ar augstu CSC marķieru līmeni izdzīvo citotoksisku terapiju un, iespējams, veicina audzēja recidīvu. Šī rezistence pret terapiju sniedz papildu funkcionālu apstiprinājumu CSC identitātei.

Pret CSC marķieriem vai CSC bagātinātiem ceļiem vērstas mērķterapijas mērķis ir iznīcināt audzēju ierosinošās šūnas. Preklīniskās un agrīnās klīniskās izstrādes stadijā ir uzsāktas pret CD44 vērstas antivielas, uz CD133 vērstas pieejas un ALDH inhibitori. Alternatīva stratēģija ir diferenciācijas terapija, kas piespiež CSC pierast pie fenotipiem, kas nav tumorogēni.

Cieto audzēju šūnu līnijas ir modeļi CSC izpētei un terapijas izstrādei. HCT116 šūnas ļauj veikt kolorektālā vēža CSC pētījumus, savukārt A549 šūnas un NCI-H460 šūnas atbalsta plaušu vēža CSC pētījumus. U87MG šūnas nodrošina glioblastomas CSC modeļus smadzeņu audzēju pētījumiem.

Kvalitātes kontrole un standartizācija

Standartizēti plūsmas citometrijas protokoli nodrošina reproducējamu CSC marķieru analīzi. Viendabīgi antivielu kloni, fluorohromu konjugāti un gating stratēģijas ļauj salīdzināt dažādus pētījumus. Atbilstošu kontroļu, tostarp izotipa kontroles un fluorescences mīnus viens (FMO) kontroles, iekļaušana nodrošina precīzu marķieru pozitīvo populāciju identifikāciju.

Šūnu līnijas autentifikācija apstiprina šūnu līnijas identitāti pirms CSC marķieru pētījumiem. Mikoplazmas testēšana novērš piesārņojumu, kas maina CSC marķieru ekspresiju un funkcionālās īpašības. Saldēšanas barotne CM-1 ļauj uzglabāt bagātinātas CSC populācijas garengriezuma pētījumiem.

Secinājumi

Vēža cilmes šūnu marķieru noteikšana joprojām ir būtiska, lai izprastu audzēja hierarhiju, prognozētu atbildes reakciju uz ārstēšanu un izstrādātu uz CSC vērstas terapijas. Lai gan ir ierosināti daudzi marķieri dažādiem audzēju tipiem, patieso CSC identitāti nosaka stingra funkcionālā validācija, izmantojot transplantāciju ar ierobežojošu atšķaidījumu, sērijveida pasāžu un diferenciācijas novērtējumu. Vienšūnu tehnoloģijas atklāj līdz šim nenovērtētu CSC heterogenitāti un plastiskumu, tādējādi apšaubot statiskas, uz marķieriem balstītas CSC definīcijas. Uz marķieriem balstītas izolācijas integrācija ar funkcionālo un molekulāro raksturojumu nodrošina visaptverošu pieeju, kas nepieciešama, lai CSC bioloģiju izmantotu uzlabotā vēža ārstēšanā.