Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

NCI grupių naudojimas sintetinio mirtingumo atrankai

Sintetinis mirtingumas - tai galinga terapinė strategija, leidžianti išnaudoti vėžinėms ląstelėms būdingus genetinius pažeidžiamumus, kartu tausojant normalius audinius. Kai praradus vieną geną ląstelės išgyvenimas priklauso nuo antrojo geno, slopinant antrąjį geną selektyviai žūsta vėžio ląstelės, turinčios pirmąją mutaciją. NCI-60 ir susijusių vėžio ląstelių linijų grupės, turinčios išsamų genomo apibūdinimą ir didelio našumo atrankinės patikros infrastruktūrą, yra idealios platformos sistemingam sintetinių mirtinų sąveikų, taikomų tiksliojoje onkologijoje, nustatymui.

Pagrindinės išvados

• NCI vėžio ląstelių linijų grupės leidžia atlikti genomo masto sintetinio mirtingumo atrankinius tyrimus naudojant siRNA, shRNA ir CRISPR bibliotekas
• Integruojant atrankinių tyrimų duomenis su genominėmis anotacijomis, nustatomos konkrečiam genotipui būdingos priklausomybės, kurias galima panaudoti terapijoje
• BRCA1/2-PARP inhibitoriaus sintetinio mirtingumo pavyzdys - sėkmingas ląstelių linijų ekranų klinikinis pritaikymas
• Funkcijos praradimo ekranai grupėse su apibrėžtomis mutacijomis identifikuoja nuo konteksto priklausomus esminius genus
• Kompiuteriniai metodai numato sintetinio mirtingumo sąveikas iš NCI grupės daugiakomponenčių duomenų

Sintetinio mirtingumo atrankinės patikros principai

Sintetinis mirtingumas pasireiškia tada, kai dviejų genų praradimas vienu metu sukelia ląstelės mirtį, o vieno iš genų praradimas toleruojamas. Vėžio atveju dėl navikui būdingų mutacijų atsiranda priklausomybė nuo partnerių genų, kurie tampa terapiniais taikiniais. Šių partnerių genų slopinimas selektyviai sunaikina vėžio ląsteles, kuriose yra jautrią mutaciją sukelianti mutacija, o normalioms ląstelėms su nepažeistais kompensaciniais keliais lieka mažiau žalos.

NCI-60 grupės išsami genominė anotacija leidžia ląstelių linijas stratifikuoti pagal mutacijos būklę, kad būtų galima atlikti lyginamąją atranką. Ląstelių linijos, kuriose yra konkrečių dominančių mutacijų, lyginamos su laukinio tipo linijomis, kad būtų galima nustatyti genus, selektyviai svarbius mutantui. Šis izogeninis palyginimas su genetiškai įvairiomis grupėmis leidžia nustatyti patikimas sintetines mirtinas sąveikas, kurios gali būti panaudotos klinikinėje praktikoje.

Didelio našumo atrankinės patikros technologijos leidžia atlikti sintetinių mirtinų sąveikų tyrimus genomo mastu. siRNA ir shRNA bibliotekos, nukreiptos į visus žmogaus genus, sistemingai nustato genus, būtinus vėžio ląstelių išgyvenimui. CRISPR-Cas9 nokauto atranka užtikrina didesnį tikslumą ir sumažina netikslinį poveikį, kuris apsunkino ankstesnius RNRi metodus. Abi technologijos buvo sėkmingai pritaikytos NCI ląstelių linijoms.

BRCA-PARP sintetinio mirtingumo paradigma

Sintetinė mirtina BRCA1/2 praradimo ir PARP slopinimo sąveika rodo sėkmingą ląstelių linijų tyrimų perkėlimą į patvirtintus vėžio gydymo būdus. BRCA trūkumo ląstelės, negalinčios atlikti homologinės rekombinacijos DNR remonto, išgyvena priklausomai nuo PARP tarpininkaujamo bazių iškirpimo remonto. PARP slopinimas BRCA mutavusiose ląstelėse sukelia DNR pažeidimų kaupimąsi ir ląstelių žūtį.

NCI panelinės ląstelių linijos padėjo patvirtinti BRCA-PARP sintetinį mirtingumą ir apibūdinti PARP inhibitorių jautrumą lemiančius veiksnius. Be germinacinių BRCA mutacijų, somatinės mutacijos ir homologinės rekombinacijos genų epigenetinis slopinimas sukuria "BRCAness" fenotipus, pagal kuriuos galima numatyti atsaką į PARP inhibitorių. Ląstelių linijų atranka nustatė šiuos alternatyvius defektus, kurie praplečia populiaciją, galinčią gauti naudos iš PARP inhibitoriaus.

HCT116 ląstelės su MLH1 trūkumu - tai MSI didelio poveikio modeliai, skirti DNR taisymo kelio inhibitoriams vertinti. Izogeninės ląstelių linijų poros su nustatytomis genetinėmis modifikacijomis leidžia atlikti kontroliuojamą sintetinio mirtingumo patikrinimą. DLD-1 ląstelės ir SW620 ląstelės yra papildomi storosios žarnos vėžio modeliai su skirtinga DNR taisymo kelio būkle.

CRISPR pagrįsta genomo atranka

CRISPR-Cas9 technologija sukėlė revoliuciją sintetinio mirtingumo atrankinėje patikroje, nes leidžia tiksliai išstumti genus su minimaliu netiksliniu poveikiu. Į ląstelių linijų populiacijas tiekiamos genomo CRISPR bibliotekos, kuriose yra į visus žmogaus genus nukreiptų vedančiųjų RNR, o laikui bėgant vedančiųjų RNR išnykimas leidžia nustatyti ląstelių išgyvenimui būtinus genus. Atliekant lyginamąją NCI ląstelių linijų atranką nustatomi nuo konteksto priklausantys esminiai genai, atstovaujantys sintetinėms mirtinoms sąveikoms.

Projekto "Achilles" ir susijusių iniciatyvų metu buvo atlikti sistemingi CRISPR tyrimai šimtams vėžio ląstelių linijų, įskaitant NCI-60 narius. Gauti priklausomybės žemėlapiai atskleidžia bendrus esminius genus, reikalingus visoms vėžinėms ląstelėms, ir kontekstui būdingą priklausomybę, susijusią su tam tikromis mutacijomis. Šis šaltinis leidžia ieškoti sintetinių mirtinų sąveikų neatliekant naujų atrankinių tyrimų.

KRAS mutavusios ląstelių linijos rodo priklausomybę nuo KRAS kelio narių, į kuriuos gali būti nukreiptas sintetinis mirtingumas. A549 ląstelės, kuriose yra KRAS G12S mutacijų, rodo priklausomybę nuo SHP2, RAF ir MEK kelio komponentų. NCI-H358 ląstelės, turinčios KRAS G12C, leidžia įvertinti aleliui būdingą sintetinio mirtingumo sąveiką. NCI-H460 ląstelės yra papildomi KRAS mutavusios stambiųjų ląstelių plaučių karcinomos modeliai.

Kompiuteriniai prognozavimo metodai

Didelės apimties daugiakomponenčių duomenų rinkiniai, gauti iš NCI grupių, leidžia kompiuteriniu būdu numatyti sintetines mirtinas sąveikas. Mašininio mokymosi algoritmai, apmokyti pagal žinomas sintetines mirtinas poras, nustato požymius, pagal kuriuos galima prognozuoti genetines sąveikas. Taikant šiuos skaičiavimo metodus, pirmenybė teikiama sąveikoms kandidatėms, kurias reikia patikrinti eksperimentiniu būdu, taip sumažinant visų galimų genų kombinacijų tikrinimo naštą.

Genų raiškos koreliacijos analizė leidžia nustatyti genus, kurie kartu išreikšti visose NCI-60 ląstelių linijose, o tai leidžia daryti prielaidą apie funkcinius ryšius. Antikoreliaciniai raiškos modeliai gali rodyti sintetinius mirtinus ryšius, kai kompensacija vyksta raiškos lygmeniu. Integruojant raiškos duomenis su modelinių organizmų genetinės sąveikos tinklais, žinios perkeliamos į žmogaus vėžio kontekstą.

Kelio lygmens analizė sugrupuoja sintetines mirtinas sąveikas pagal funkcines kategorijas. Sintetinių mirtinų sąveikų, kurias būtų galima panaudoti terapijoje, yra daugiau DNR pažeidimų atsako, ląstelių ciklo reguliavimo ir medžiagų apykaitos keliuose. Ši kelio perspektyva nukreipia taikinių atranką į sąveikas su keliais vaistais valdomais mazgais.

Priklausomybė nuo onkogenų ir sintetinis mirtingumas

Priklausomybė nuo onkogenų yra ypatingas sintetinio mirtingumo atvejis, kai vėžinės ląstelės priklauso nuo nuolatinio varomųjų onkogenų aktyvumo. Onkogeninio signalo nutraukimas genetinėmis ar farmakologinėmis priemonėmis sukelia ląstelių mirtį, nepaisant to, kad yra kitų mutacijų. NCI panelinė atranka nustato genus, kurie yra reikalingi būtent onkogenų varomojo veiksnio kontekste.

MYC valdomos NCI-60 ląstelių linijos rodo priklausomybę nuo MYC reguliuojamų medžiagų apykaitos ir biosintezės programų. Nors patį MYC vis dar sunku tiesiogiai paveikti, sintetiniai mirtini partneriai, įskaitant CDK9, AURKA ir medžiagų apykaitos fermentus, yra alternatyvūs intervencijos taškai. MYC amplifikuotų ir diploidinių ląstelių linijų atrankinė patikra leidžia nustatyti šias tikslines priklausomybes.

K562 BCR-ABL valdomosląstelės demonstruoja gilią priklausomybę nuo onkogeno, kurią išnaudoja imatinibas ir susiję TKI. Šis modelis leidžia ištirti mechanizmus, palaikančius priklausomybę nuo onkogeno, ir įgytos rezistencijos įveikimo strategijas. HL-60 ląstelės yra MYC amplifikuotos ūminės mieloidinės leukemijos modeliai sintetinio mirtingumo tyrimams.

Patvirtinimas ir klinikinis pritaikymas

Sintetinio mirtingumo sąveikas, nustatytas atliekant NCI grupės atranką, prieš pradedant taikyti klinikinėje praktikoje, reikia griežtai patvirtinti. Nepriklausomas patvirtinimas naudojant ortogonalius metodus (skirtingus RNRi reagentus, CRISPR, mažąsias molekules) užtikrina patikimumą. Patvirtinimas keliose ląstelių linijose su bendromis mutacijomis parodo, kad galima apibendrinti ne tik atskirų ląstelių linijų kontekste.

Pacientų ksenograftų (PDX) modeliai suteikia kliniškai svarbų kontekstą sintetinio mirtingumo patvirtinimui. Vaistų deriniai, kuriuose naudojamos sintetinio mirtingumo sąveikos, vertinami PDX modeliuose, gautuose iš pacientų su atitinkamomis mutacijomis. Šis pakopinis patvirtinimas didina klinikinio pritaikymo patikimumą, nes parodo aktyvumą modeliuose, kuriuose išlaikomas pacientų navikų heterogeniškumas.

Kokybės užtikrinimas užtikrina patikimus atrankinės patikros rezultatus. Ląstelių linijų autentiškumo patvirtinimas patvirtina ląstelių linijų tapatybę, o tai labai svarbu atsižvelgiant į dokumentais patvirtintas klaidingo identifikavimo problemas. Mikoplazmų tyrimas užtikrina kultūrų vientisumą per visas atrankinės patikros kampanijas. RPMI 1640 terpė ir DMEM užtikrina standartizuotas auginimo sąlygas, leidžiančias gauti nuoseklius atrankinės patikros rezultatus.

Nauji sintetiniai mirtini taikiniai

Be PARP inhibitorių, klinikinio vystymo metu tobulinamos kelios sintetinės mirtinos terapijos strategijos. ARID1A mutavęs vėžys pasižymi sintetiniu mirtingumu slopinant EZH2, todėl tazemetostatas pradėtas naudoti epitelioidinei sarkomai ir folikulinei limfomai gydyti. ATR ir CHK1 inhibitoriai išnaudoja sintetinį mirtingumą ATM trūkumo vėžiuose, negalinčiuose aktyvuoti alternatyvių DNR pažeidimų kontrolės taškų.

Metabolinis sintetinis mirtingumas nukreiptas į vėžiui būdingą metabolinę priklausomybę. Vėžiai, kuriems būdingas specifinis onkogeno aktyvavimas arba naviko slopintojo praradimas, pasižymi pakitusiu medžiagų apykaitos kelių panaudojimu, dėl kurio atsiranda vaistų pažeidžiamumas. NCI grupės metabolomikos ir jautrumo vaistams duomenys padeda nustatyti metabolinio sintetinio mirtingumo sąveikas.

Imunoterapijos sintetinis mirtingumas - tai nauja koncepcija, kai genetiniai pokyčiai nusako atsaką į imuninių kontrolinių taškų inhibitorius. Praradus antigeno pateikimo mechanizmo genus, atsiranda priklausomybė nuo kontrolinių taškų slopinimo, kad būtų išvengta imuninės sistemos. NCI grupės su imunine sistema susijusių genų raiškos apibūdinimas padeda numatyti imunoterapijos sintetinį mirtingumą.

Išvada

NCI vėžio ląstelių linijų grupės yra esminės platformos sistemingam sintetinio letalumo sąveikų nustatymui ir patvirtinimui. Sėkmingas BRCA-PARP sintetinio mirtingumo tyrimas rodo, kad ląstelių linijomis pagrįsti atradimai gali būti pritaikomi praktikoje. CRISPR atrankos technologijos ir kompiuterinio prognozavimo metodų pažanga toliau plečia naudotinų sintetinių mirtinų sąveikų katalogą. Atrankos duomenų integravimas su klinikiniu patvirtinimu pacientų modeliuose pagreitina sintetinio mirtingumo atradimų perkėlimą į geresnį vėžio gydymą.