Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

Χρήση πάνελ NCI για διαλογή συνθετικής θνησιμότητας

Η συνθετική θνησιμότητα αποτελεί μια ισχυρή θεραπευτική στρατηγική που εκμεταλλεύεται γενετικά τρωτά σημεία ειδικά για τα καρκινικά κύτταρα, ενώ παράλληλα προστατεύει τους φυσιολογικούς ιστούς. Όταν η απώλεια ενός γονιδίου δημιουργεί εξάρτηση από ένα δεύτερο γονίδιο για την κυτταρική επιβίωση, η αναστολή του δεύτερου γονιδίου σκοτώνει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα που φέρουν την πρώτη μετάλλαξη. Οι πίνακες καρκινικών κυτταρικών σειρών NCI-60 και συναφών σειρών, με ολοκληρωμένο γονιδιωματικό χαρακτηρισμό και υποδομή διαλογής υψηλής απόδοσης, παρέχουν ιδανικές πλατφόρμες για τον συστηματικό εντοπισμό συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων που εφαρμόζονται στην ογκολογία ακριβείας.

Βασικά συμπεράσματα

• Τα πάνελ καρκινικών κυτταρικών σειρών NCI επιτρέπουν τις οθόνες συνθετικής θνησιμότητας σε κλίμακα γονιδιώματος με τη χρήση βιβλιοθηκών siRNA, shRNA και CRISPR
• Η ενσωμάτωση των δεδομένων της διαλογής με γονιδιωματικούς σχολιασμούς εντοπίζει εξαρτήσεις συγκεκριμένων γονότυπων που μπορούν να αξιοποιηθούν θεραπευτικά
• Η συνθετική θνησιμότητα του αναστολέα BRCA1/2-PARP αποτελεί παράδειγμα επιτυχούς κλινικής μετάφρασης από οθόνες κυτταρικών σειρών
• Οι οθόνες απώλειας λειτουργίας σε ομάδες με καθορισμένες μεταλλάξεις εντοπίζουν εξαρτώμενα από το πλαίσιο βασικά γονίδια
• Υπολογιστικές προσεγγίσεις προβλέπουν συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις από πολυομικά δεδομένα πάνελ NCI

Αρχές του συνθετικού ελέγχου θνησιμότητας

Συνθετική θνησιμότητα προκύπτει όταν η ταυτόχρονη απώλεια δύο γονιδίων προκαλεί κυτταρικό θάνατο, ενώ η απώλεια ενός από τα δύο γονίδια είναι ανεκτή. Στον καρκίνο, οι μεταλλάξεις ειδικά για τον όγκο δημιουργούν εξαρτήσεις από γονίδια εταίρους που γίνονται θεραπευτικοί στόχοι. Η αναστολή αυτών των συνεργαζόμενων γονιδίων σκοτώνει επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα που φέρουν την ευαισθητοποιητική μετάλλαξη, ενώ συγχρόνως γλιτώνουν τα φυσιολογικά κύτταρα με άθικτα αντισταθμιστικά μονοπάτια.

Ο περιεκτικός γονιδιωματικός σχολιασμός του πάνελ NCI-60 επιτρέπει τη διαστρωμάτωση των κυτταρικών σειρών ανάλογα με την κατάσταση μετάλλαξης για συγκριτικό έλεγχο. Οι κυτταρικές σειρές που φέρουν συγκεκριμένες μεταλλάξεις ενδιαφέροντος συγκρίνονται με σειρές άγριου τύπου για τον εντοπισμό γονιδίων που είναι επιλεκτικά απαραίτητα στο μεταλλαγμένο πλαίσιο. Αυτή η ισογονική σύγκριση σε ένα γενετικά ποικίλο πάνελ εντοπίζει ισχυρές συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις με δυνατότητα κλινικής μετάφρασης.

Οι τεχνολογίες διαλογής υψηλής απόδοσης επιτρέπουν την εξέταση συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων σε κλίμακα γονιδιώματος. Οι βιβλιοθήκες siRNA και shRNA που στοχεύουν σε όλα τα ανθρώπινα γονίδια εντοπίζουν συστηματικά γονίδια απαραίτητα για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Οι οθόνες αποκλεισμού CRISPR-Cas9 παρέχουν υψηλότερη ακρίβεια και μειώνουν τα αποτελέσματα εκτός στόχου που περιέπλεκαν τις προηγούμενες προσεγγίσεις RNAi. Και οι δύο τεχνολογίες έχουν αναπτυχθεί με επιτυχία σε κυτταρικές σειρές του πίνακα NCI.

Παράδειγμα συνθετικής θνησιμότητας BRCA-PARP

Η συνθετική θανατηφόρος αλληλεπίδραση μεταξύ της απώλειας BRCA1/2 και της αναστολής της PARP αποτελεί παράδειγμα επιτυχούς μετάφρασης από τις οθόνες κυτταρικών σειρών σε εγκεκριμένες θεραπείες καρκίνου. Τα κύτταρα με ανεπάρκεια BRCA, τα οποία δεν μπορούν να επιδιορθώσουν το DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό, εξαρτώνται από την επιδιόρθωση αποκοπής βάσεων με τη μεσολάβηση της PARP για την επιβίωσή τους. Η αναστολή της PARP σε μεταλλαγμένα κύτταρα BRCA προκαλεί συσσώρευση βλαβών στο DNA και κυτταρικό θάνατο.

Οι κυτταρικές σειρές του NCI panel συνέβαλαν καθοριστικά στην επικύρωση της συνθετικής θνησιμότητας BRCA-PARP και στον χαρακτηρισμό των καθοριστικών παραγόντων της ευαισθησίας στον αναστολέα PARP. Πέρα από τις μεταλλάξεις BRCA της γεννητικής γραμμής, οι σωματικές μεταλλάξεις και η επιγενετική αποσιώπηση των γονιδίων ομόλογου ανασυνδυασμού δημιουργούν φαινότυπους "BRCAness" που προβλέπουν την απόκριση στον αναστολέα PARP. Η διαλογή κυτταρικών σειρών εντόπισε αυτές τις εναλλακτικές ατέλειες διευρύνοντας τον πληθυσμό που δυνητικά επωφελείται από την αναστολή της PARP.

Τα κύτταρα HCT116 με ανεπάρκεια MLH1 παρέχουν μοντέλα με υψηλό MSI για την αξιολόγηση των αναστολέων της οδού επιδιόρθωσης του DNA. Τα ισογονικά ζεύγη κυτταρικών σειρών με καθορισμένες γενετικές τροποποιήσεις επιτρέπουν την ελεγχόμενη επικύρωση της συνθετικής θνησιμότητας. Τα κύτταρα DLD-1 και τα κύτταρα SW620 συνεισφέρουν πρόσθετα μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου με διαφορετική κατάσταση της οδού επιδιόρθωσης του DNA.

Διαλογή σε όλο το γονιδίωμα με βάση το CRISPR

Η τεχνολογία CRISPR-Cas9 έχει φέρει επανάσταση στον έλεγχο συνθετικής θνησιμότητας, επιτρέποντας ακριβές νοκ-άουτ γονιδίων με ελάχιστες επιπτώσεις εκτός στόχου. Βιβλιοθήκες CRISPR σε όλο το γονιδίωμα που περιέχουν RNA-οδηγούς που στοχεύουν όλα τα ανθρώπινα γονίδια παραδίδονται σε πληθυσμούς κυτταρικών σειρών και η εξάντληση των οδηγών με την πάροδο του χρόνου προσδιορίζει γονίδια απαραίτητα για την επιβίωση των κυττάρων. Ο συγκριτικός έλεγχος σε όλες τις κυτταρικές σειρές του πίνακα NCI εντοπίζει εξαρτώμενα από το πλαίσιο βασικά γονίδια που αντιπροσωπεύουν συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις.

Το πρόγραμμα Achilles και οι συναφείς πρωτοβουλίες έχουν πραγματοποιήσει συστηματικές οθόνες CRISPR σε εκατοντάδες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των μελών του NCI-60. Οι χάρτες εξάρτησης που προέκυψαν αποκαλύπτουν κοινά βασικά γονίδια που απαιτούνται από όλα τα καρκινικά κύτταρα και εξαρτήσεις που σχετίζονται με συγκεκριμένα μεταλλάγματα. Αυτός ο πόρος επιτρέπει την εξόρυξη συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων χωρίς τη διεξαγωγή νέων οθονών.

Οι κυτταρικές σειρές με μετάλλαξη KRAS καταδεικνύουν εξαρτήσεις από μέλη του μονοπατιού KRAS που είναι δυνητικά στοχεύσιμα μέσω προσεγγίσεων συνθετικής θνησιμότητας. Τα κύτταρα A549 που φέρουν μεταλλάξεις KRAS G12S παρουσιάζουν εξάρτηση από τα στοιχεία του μονοπατιού SHP2, RAF και MEK. Τα κύτταρα NCI-H358 με KRAS G12C επιτρέπουν την αξιολόγηση αλληλεπιδράσεων συνθετικής θνησιμότητας ειδικά για το αλληλόμορφο. Τα κύτταρα NCI-H460 παρέχουν πρόσθετα μοντέλα πολυκυτταρικού καρκινώματος του πνεύμονα με μετάλλαξη KRAS.

Υπολογιστικές προσεγγίσεις πρόβλεψης

Τα μεγάλης κλίμακας πολυομικά σύνολα δεδομένων που παράγονται από τις ομάδες NCI επιτρέπουν την υπολογιστική πρόβλεψη συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων. Οι αλγόριθμοι μηχανικής μάθησης που εκπαιδεύονται σε γνωστά συνθετικά θανατηφόρα ζεύγη εντοπίζουν χαρακτηριστικά που προβλέπουν γενετικές αλληλεπιδράσεις. Αυτές οι υπολογιστικές προσεγγίσεις ιεραρχούν τις υποψήφιες αλληλεπιδράσεις για πειραματική επικύρωση, μειώνοντας την επιβάρυνση του ελέγχου κάθε πιθανού συνδυασμού γονιδίων.

Η ανάλυση συσχέτισης γονιδιακής έκφρασης εντοπίζει γονίδια που συν-εκφράζονται σε όλες τις κυτταρικές σειρές NCI-60, υποδηλώνοντας λειτουργικές σχέσεις. Τα αντι-συσχετιζόμενα μοτίβα έκφρασης μπορεί να υποδεικνύουν συνθετικές θανατηφόρες σχέσεις όπου η αντιστάθμιση λαμβάνει χώρα σε επίπεδο έκφρασης. Η ενσωμάτωση δεδομένων έκφρασης με δίκτυα γενετικών αλληλεπιδράσεων από πρότυπους οργανισμούς μεταφέρει τη γνώση σε ανθρώπινα καρκινικά πλαίσια.

Η ανάλυση σε επίπεδο μονοπατιών ομαδοποιεί τις συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις με βάση λειτουργικές κατηγορίες. Η απόκριση σε βλάβη του DNA, η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και τα μεταβολικά μονοπάτια είναι εμπλουτισμένα για συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις που μπορούν να αξιοποιηθούν θεραπευτικά. Αυτή η προοπτική των μονοπατιών καθοδηγεί την επιλογή των στόχων προς αλληλεπιδράσεις με πολλαπλούς κόμβους που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φάρμακα.

Εθισμός στα ογκογονίδια και συνθετική θανατηφόρα δράση

Ο εθισμός στα ογκογονίδια αντιπροσωπεύει μια ειδική περίπτωση συνθετικής θνησιμότητας, όπου τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται από τη συνεχή δραστηριότητα των ογκογονιδίων-οδηγών. Η απόσυρση της ογκογονικής σηματοδότησης μέσω γενετικών ή φαρμακολογικών μέσων προκαλεί κυτταρικό θάνατο παρά την παρουσία άλλων μεταλλάξεων. Ο έλεγχος της ομάδας NCI εντοπίζει γονίδια που απαιτούνται ειδικά σε ογκογονιδιακά καθοδηγούμενα περιβάλλοντα.

Οι κυτταρικές σειρές που οδηγούνται από MYC στο πλαίσιο του NCI-60 επιδεικνύουν εξαρτήσεις από μεταβολικά και βιοσυνθετικά προγράμματα που ρυθμίζονται από MYC. Ενώ ο ίδιος ο MYC παραμένει δύσκολο να στοχευθεί άμεσα, οι συνθετικοί θανατηφόροι εταίροι, συμπεριλαμβανομένων των CDK9, AURKA και μεταβολικών ενζύμων, παρέχουν εναλλακτικά σημεία παρέμβασης. Η διαλογή σε κυτταρικές σειρές με πολλαπλασιασμό MYC σε σχέση με διπλοειδείς κυτταρικές σειρές εντοπίζει αυτές τις στοχευόμενες εξαρτήσεις.

Τα κύτταρα K562 που οδηγούνται από τον BCR-ABL επιδεικνύουν βαθιά ογκογονιδιακή εξάρτηση που αξιοποιείται από την ιματινίμπη και τις συναφείς ΤΚΙ. Αυτό το μοντέλο επιτρέπει τη διερεύνηση των μηχανισμών που διατηρούν τον εθισμό στα ογκογονίδια και των στρατηγικών για την αντιμετώπιση της επίκτητης αντοχής. Τα κύτταρα HL-60 παρέχουν μοντέλα οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας με ενίσχυση MYC για μελέτες συνθετικής θνησιμότητας.

Επικύρωση και κλινική μετάφραση

Οι συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις που εντοπίζονται μέσω της διαλογής της ομάδας NCI απαιτούν αυστηρή επικύρωση πριν από την κλινική μετάφραση. Ανεξάρτητη επιβεβαίωση με τη χρήση ορθογώνιων μεθόδων (διαφορετικά αντιδραστήρια RNAi, CRISPR, μικρά μόρια) καθιερώνει την ευρωστία. Η επικύρωση σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές με κοινές μεταλλάξεις καταδεικνύει τη δυνατότητα γενίκευσης πέρα από τα πλαίσια μεμονωμένων κυτταρικών σειρών.

Τα μοντέλα ξενομοσχευμάτων που προέρχονται από ασθενείς (PDX) παρέχουν κλινικά συναφή πλαίσια για την επικύρωση της συνθετικής θνησιμότητας. Συνδυασμοί φαρμάκων που εκμεταλλεύονται συνθετικές θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις αξιολογούνται σε μοντέλα PDX που προέρχονται από ασθενείς με σχετικές μεταλλάξεις. Αυτή η σταδιακή επικύρωση αυξάνει την εμπιστοσύνη στην κλινική μετάφραση, αποδεικνύοντας τη δραστικότητα σε μοντέλα που διατηρούν την ετερογένεια των όγκων των ασθενών.

Η διασφάλιση ποιότητας εξασφαλίζει αξιόπιστα αποτελέσματα ελέγχου. Η πιστοποίηση ταυτότητας κυτταρικής γραμμής επιβεβαιώνει την ταυτότητα της κυτταρικής γραμμής, γεγονός απαραίτητο δεδομένων των τεκμηριωμένων προβλημάτων λανθασμένης ταυτοποίησης. Η δοκιμή μυκοπλάσματος διατηρεί την ακεραιότητα της καλλιέργειας καθ' όλη τη διάρκεια των εκστρατειών διαλογής. Τα μέσα RPMI 1640 και DMEM παρέχουν τυποποιημένες συνθήκες καλλιέργειας για συνεπή αποτελέσματα διαλογής.

Αναδυόμενοι συνθετικοί θανατηφόροι στόχοι

Πέρα από τους αναστολείς της PARP, πολλαπλές συνθετικές θανατηφόρες θεραπευτικές στρατηγικές προχωρούν στην κλινική ανάπτυξη. Οι καρκίνοι με μετάλλαξη ARID1A επιδεικνύουν συνθετική θανατηφόρα δράση με την αναστολή της EZH2, οδηγώντας στην ανάπτυξη της ταζεμετοστάτης για το επιθηλιοειδές σάρκωμα και το οζώδες λέμφωμα. Οι αναστολείς των ATR και CHK1 εκμεταλλεύονται τη συνθετική θνησιμότητα σε καρκίνους με ανεπάρκεια ATM που δεν μπορούν να ενεργοποιήσουν εναλλακτικά σημεία ελέγχου βλάβης του DNA.

Η μεταβολική συνθετική θνησιμότητα στοχεύει σε ειδικές για τον καρκίνο μεταβολικές εξαρτήσεις. Οι όγκοι με ειδική ενεργοποίηση ογκογονιδίων ή απώλεια ογκοκατασταλτικών παραγόντων επιδεικνύουν τροποποιημένη χρήση μεταβολικών μονοπατιών που δημιουργεί ευπάθειες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φάρμακα. Τα δεδομένα μεταβολωμικής και ευαισθησίας φαρμάκων της ομάδας NCI ενημερώνουν για τον εντοπισμό των μεταβολικών συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων.

Η συνθετική θνησιμότητα της ανοσοθεραπείας αντιπροσωπεύει μια αναδυόμενη έννοια όπου οι γενετικές μεταβολές προβλέπουν την ανταπόκριση σε αναστολείς σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος. Η απώλεια γονιδίων του μηχανισμού παρουσίασης αντιγόνων δημιουργεί εξάρτηση από την αναστολή των σημείων ελέγχου για την ανοσολογική αποφυγή. Ο χαρακτηρισμός της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα από την ομάδα NCI ενημερώνει για την πρόβλεψη της συνθετικής θνησιμότητας της ανοσοθεραπείας.

Συμπέρασμα

Τα πάνελ καρκινικών κυτταρικών σειρών NCI παρέχουν βασικές πλατφόρμες για τον συστηματικό προσδιορισμό και την επικύρωση των συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων. Η επιτυχία της συνθετικής θνησιμότητας BRCA-PARP καταδεικνύει τις μεταφραστικές δυνατότητες της ανακάλυψης με βάση τις κυτταρικές σειρές. Οι εξελίξεις στην τεχνολογία διαλογής CRISPR και οι υπολογιστικές προσεγγίσεις πρόβλεψης συνεχίζουν να διευρύνουν τον κατάλογο των συνθετικών θανατηφόρων αλληλεπιδράσεων που μπορούν να αναληφθούν. Η ενσωμάτωση των δεδομένων διαλογής με κλινική επικύρωση σε μοντέλα που προέρχονται από ασθενείς επιταχύνει τη μετάφραση των ανακαλύψεων συνθετικής θνησιμότητας σε βελτιωμένη θεραπεία του καρκίνου.