Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

Používanie panelov NCI na skríning syntetickej letality

Syntetická letalita predstavuje účinnú terapeutickú stratégiu využívajúcu genetické zraniteľnosti špecifické pre rakovinové bunky, pričom šetrí normálne tkanivá. Ak strata jedného génu spôsobí závislosť buniek od druhého génu, inhibícia druhého génu selektívne zabíja rakovinové bunky s prvou mutáciou. Panel NCI-60 a príbuzné panely rakovinových bunkových línií s komplexnou genomickou charakterizáciou a vysoko výkonnou skríningovou infraštruktúrou poskytujú ideálne platformy na systematickú identifikáciu syntetických letálnych interakcií použiteľných v precíznej onkológii.

Kľúčové poznatky

• Panely rakovinových bunkových línií NCI umožňujú skríningy syntetickej letality v genómovom meradle pomocou knižníc siRNA, shRNA a CRISPR
• Integrácia skríningových údajov s genomickými anotáciami identifikuje závislosti špecifické pre genotyp využiteľné terapeuticky
• Syntetická letalita inhibítorov BRCA1/2-PARP je príkladom úspešného klinického využitia skríningov bunkových línií
• Skríny straty funkcie v paneloch s definovanými mutáciami identifikujú kontextovo závislé esenciálne gény
• Výpočtové prístupy predpovedajú interakcie syntetickej letality z multiomických údajov panelu NCI

Zásady skríningu syntetickej letality

Syntetická letalita nastáva vtedy, keď súčasná strata dvoch génov spôsobí smrť bunky, zatiaľ čo strata jedného z génov je tolerovaná. V prípade rakoviny vytvárajú nádorovo špecifické mutácie závislosť od partnerských génov, ktoré sa stávajú terapeutickými cieľmi. Inhibícia týchto partnerských génov selektívne zabíja rakovinové bunky, ktoré sú nositeľmi senzitívnej mutácie, pričom šetrí normálne bunky s neporušenými kompenzačnými dráhami.

Komplexná genomická anotácia panelu NCI-60 umožňuje stratifikáciu bunkových línií podľa stavu mutácie na účely porovnávacieho skríningu. Bunkové línie nesúce špecifické mutácie, ktoré sú predmetom záujmu, sa porovnávajú s líniami divokého typu s cieľom identifikovať gény, ktoré sú selektívne nevyhnutné v kontexte mutácie. Toto izogénne porovnanie v rámci geneticky rôznorodého panelu identifikuje robustné syntetické letálne interakcie s potenciálom pre klinickú aplikáciu.

Vysoko výkonné skríningové technológie umožňujú skúmanie syntetických letálnych interakcií v genómovom meradle. siRNA a shRNA knižnice zamerané na všetky ľudské gény systematicky identifikujú gény nevyhnutné pre prežitie rakovinových buniek. CRISPR-Cas9 knockout screeny poskytujú vyššiu presnosť a znižujú off-target efekty, ktoré komplikovali predchádzajúce RNAi prístupy. Obe technológie boli úspešne nasadené na bunkových líniách panelu NCI.

Syntetická paradigma letality BRCA-PARP

Syntetická letálna interakcia medzi stratou BRCA1/2 a inhibíciou PARP je príkladom úspešného prechodu od skríningov bunkových línií k schváleným terapiám rakoviny. Bunky s deficitom BRCA, ktoré nie sú schopné vykonávať homologickú rekombináciu DNA, sú pri prežití závislé od opravy bázy sprostredkovanej PARP. Inhibícia PARP v bunkách s mutáciou BRCA spôsobuje akumuláciu poškodenia DNA a bunkovú smrť.

Bunkové línie panelu NCI boli nápomocné pri overovaní syntetickej letality BRCA-PARP a charakterizovaní determinantov citlivosti na inhibítory PARP. Okrem zárodočných mutácií BRCA vytvárajú somatické mutácie a epigenetické umlčanie génov homologickej rekombinácie fenotypy "BRCAness", ktoré predpovedajú odpoveď na inhibítor PARP. Skríning bunkových línií identifikoval tieto alternatívne defekty rozširujúce populáciu potenciálne profitujúcu z inhibície PARP.

Bunky HCT116 s deficitom MLH1 poskytujú modely s vysokým stupňom MSI na hodnotenie inhibítorov dráhy opravy DNA. Páry izogénnych bunkových línií s definovanými genetickými modifikáciami umožňujú kontrolované overovanie syntetickej letality. Bunky DLD-1 a SW620 prispievajú k ďalším modelom kolorektálneho karcinómu s odlišným stavom dráhy opravy DNA.

Skríning celého genómu na báze CRISPR

Technológia CRISPR-Cas9 spôsobila revolúciu v skríningu syntetickej letality tým, že umožňuje presné vyradenie génov s minimálnymi účinkami mimo cieľa. Genómové knižnice CRISPR obsahujúce vodiace RNA zamerané na všetky ľudské gény sa dodávajú do populácií bunkových línií a vyčerpanie vodiacich RNA v priebehu času identifikuje gény nevyhnutné pre prežitie buniek. Porovnávacím skríningom naprieč bunkovými líniami panelu NCI sa identifikujú kontextovo závislé esenciálne gény predstavujúce syntetické letálne interakcie.

V rámci projektu Achilles a súvisiacich iniciatív sa uskutočnili systematické skríningy CRISPR v stovkách nádorových bunkových línií vrátane členov NCI-60. Výsledné mapy závislostí odhaľujú spoločné esenciálne gény vyžadované všetkými rakovinovými bunkami a kontextovo špecifické závislosti spojené s konkrétnymi mutáciami. Tento zdroj umožňuje vyhľadávanie syntetických letálnych interakcií bez vykonávania nových skríningov.

Bunkové línie s mutáciou KRAS vykazujú závislosti od členov dráhy KRAS, na ktoré možno potenciálne cieliť pomocou prístupov syntetickej letality. Bunky A549 nesúce mutácie KRAS G12S vykazujú závislosť od zložiek dráhy SHP2, RAF a MEK. Bunky NCI-H358 s mutáciou KRAS G12C umožňujú hodnotenie alelovo špecifických interakcií syntetickej letality. Bunky NCI-H460 poskytujú ďalšie modely veľkobunkového karcinómu pľúc s mutáciou KRAS.

Výpočtové prístupy predpovedania

Rozsiahle súbory multiomických údajov generované z panelov NCI umožňujú počítačovú predikciu syntetických letálnych interakcií. Algoritmy strojového učenia vyškolené na známych syntetických letálnych pároch identifikujú vlastnosti predpovedajúce genetické interakcie. Tieto počítačové prístupy uprednostňujú kandidátske interakcie na experimentálne overenie, čím znižujú záťaž spojenú s preverovaním každej možnej kombinácie génov.

Analýza korelácie génovej expresie identifikuje gény spoločne exprimované v bunkových líniách NCI-60, čo naznačuje funkčné vzťahy. Antikorelované vzorce expresie môžu naznačovať syntetické letálne vzťahy, pri ktorých dochádza ku kompenzácii na úrovni expresie. Integrácia údajov o expresii so sieťami genetických interakcií z modelových organizmov prenáša poznatky do kontextu ľudskej rakoviny.

Analýza na úrovni ciest zoskupuje syntetické letálne interakcie podľa funkčných kategórií. Reakcia na poškodenie DNA, regulácia bunkového cyklu a metabolické dráhy sú obohatené o syntetické letálne interakcie využiteľné z terapeutického hľadiska. Táto perspektíva ciest usmerňuje výber cieľov smerom k interakciám s viacerými uzlami, ktoré sú liečivé.

Onkogénna závislosť a syntetická letalita

Onkogénová závislosť predstavuje špeciálny prípad syntetickej letality, keď rakovinové bunky závisia od pokračujúcej aktivity riadiacich onkogénov. Odstránenie onkogénnej signalizácie genetickými alebo farmakologickými prostriedkami spôsobuje smrť buniek napriek prítomnosti iných mutácií. Skríningový panel NCI identifikuje gény, ktoré sa vyžadujú špecificky v kontextoch riadených onkogénmi.

Bunkové línie riadené MYC v rámci NCI-60 vykazujú závislosť od metabolických a biosyntetických programov regulovaných MYC. Zatiaľ čo samotný MYC je stále náročné priamo zacieliť, syntetickí letálni partneri vrátane CDK9, AURKA a metabolických enzýmov poskytujú alternatívne intervenčné body. Skríning v MYC-amplifikovaných a diploidných bunkových líniách identifikuje tieto cielené závislosti.

Bunky K562 poháňané BCR-ABL vykazujú hlbokú závislosť od onkogénu využívanú imatinibom a príbuznými TKI. Tento model umožňuje skúmať mechanizmy udržiavajúce závislosť od onkogénu a stratégie na prekonanie získanej rezistencie. Bunky HL-60 poskytujú modely akútnej myeloidnej leukémie s amplifikáciou MYC na štúdie syntetickej letality.

Validácia a klinické využitie

Syntetické letálne interakcie identifikované prostredníctvom skríningu panelu NCI si vyžadujú prísnu validáciu pred klinickou aplikáciou. Nezávislé potvrdenie pomocou ortogonálnych metód (rôzne činidlá RNAi, CRISPR, malé molekuly) stanovuje robustnosť. Validácia vo viacerých bunkových líniách so spoločnými mutáciami preukazuje zovšeobecniteľnosť mimo kontextu jednotlivých bunkových línií.

Modely xenotransplantátov odvodených od pacientov (PDX) poskytujú klinicky relevantné kontexty na validáciu syntetickej letality. Kombinácie liečiv využívajúce syntetické letálne interakcie sa hodnotia na PDX modeloch odvodených od pacientov s príslušnými mutáciami. Táto postupná validácia zvyšuje dôveru v klinickú aplikáciu preukázaním aktivity v modeloch zachovávajúcich heterogenitu nádorov pacientov.

Zabezpečenie kvality zaručuje spoľahlivé výsledky skríningu. Autentifikácia bunkových línií potvrdzuje identitu bunkových línií, čo je nevyhnutné vzhľadom na zdokumentované problémy s nesprávnou identifikáciou. Testovanie mykoplaziem udržiava integritu kultúry počas skríningových kampaní. Médium RPMI 1640 a DMEM poskytujú štandardizované kultivačné podmienky pre konzistentné výsledky skríningu.

Nové syntetické smrtiace ciele

Okrem inhibítorov PARP postupujú v klinickom vývoji viaceré syntetické smrtiace terapeutické stratégie. Rakovina s mutáciou ARID1A vykazuje syntetickú letalitu pri inhibícii EZH2, čo viedlo k vývoju tazemetostatu pre epiteloidný sarkóm a folikulárny lymfóm. Inhibítory ATR a CHK1 využívajú syntetickú letalitu v rakovinách s deficitom ATM, ktoré nie sú schopné aktivovať alternatívne kontrolné body poškodenia DNA.

Metabolická syntetická letalita sa zameriava na metabolické závislosti špecifické pre rakovinu. Nádory so špecifickou aktiváciou onkogénov alebo stratou nádorových supresorov vykazujú zmenené využitie metabolických dráh, ktoré vytvárajú zraniteľnosť liekmi. Metabolomické údaje panelu NCI a údaje o citlivosti na lieky poskytujú informácie o identifikácii metabolických syntetických smrtiacich interakcií.

Syntetická letalita pri imunoterapii predstavuje nový koncept, v ktorom genetické zmeny predpovedajú odpoveď na inhibítory kontrolných bodov imunitného systému. Strata génov antigénových prezentačných mechanizmov vytvára závislosť od inhibície kontrolných bodov pri imunitnom úniku. Charakterizácia expresie génov súvisiacich s imunitným systémom v paneli NCI poskytuje informácie na predpovedanie syntetickej letality pri imunoterapii.

Záver

Panely nádorových bunkových línií NCI poskytujú základné platformy na systematickú identifikáciu a validáciu interakcií syntetickej letality. Úspech syntetickej letality BRCA-PARP dokazuje translačný potenciál objavovania na základe bunkových línií. Pokroky v skríningovej technológii CRISPR a počítačové predpovedné prístupy naďalej rozširujú katalóg použiteľných syntetických letálnych interakcií. Integrácia skríningových údajov s klinickou validáciou na modeloch odvodených od pacientov urýchľuje transformáciu objavov syntetickej letality na zlepšenie liečby rakoviny.