Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

Korzystanie z paneli NCI do badań przesiewowych syntetycznej letalności

Syntetyczna letalność stanowi potężną strategię terapeutyczną wykorzystującą słabości genetyczne specyficzne dla komórek nowotworowych, oszczędzając jednocześnie normalne tkanki. Gdy utrata jednego genu tworzy zależność od drugiego genu dla przetrwania komórki, hamowanie drugiego genu selektywnie zabija komórki nowotworowe niosące pierwszą mutację. Panele NCI-60 i pokrewnych linii komórek nowotworowych, z kompleksową charakterystyką genomową i infrastrukturą przesiewową o wysokiej przepustowości, stanowią idealne platformy do systematycznej identyfikacji syntetycznych śmiertelnych interakcji mających zastosowanie w precyzyjnej onkologii.

Kluczowe wnioski

• Panele linii komórek nowotworowych NCI umożliwiają badania przesiewowe syntetycznej letalności w skali genomu przy użyciu bibliotek siRNA, shRNA i CRISPR
• Integracja danych przesiewowych z adnotacjami genomowymi identyfikuje zależności specyficzne dla genotypu, które można wykorzystać terapeutycznie
• Syntetyczna letalność inhibitora BRCA1/2-PARP jest przykładem udanego przełożenia klinicznego z badań przesiewowych na liniach komórkowych
• Badania przesiewowe utraty funkcji w panelach ze zdefiniowanymi mutacjami identyfikują istotne geny zależne od kontekstu
• Podejścia obliczeniowe przewidują syntetyczne śmiertelne interakcje na podstawie wieloomowych danych z panelu NCI

Zasady badań przesiewowych syntetycznej letalności

Syntetyczna letalność występuje, gdy jednoczesna utrata dwóch genów powoduje śmierć komórki, podczas gdy utrata jednego z nich jest tolerowana. W nowotworach mutacje specyficzne dla guza tworzą zależności od genów partnerskich, które stają się celami terapeutycznymi. Zahamowanie tych genów partnerskich selektywnie zabija komórki nowotworowe z mutacją uczulającą, oszczędzając jednocześnie normalne komórki z nienaruszonymi szlakami kompensacyjnymi.

Kompleksowa adnotacja genomiczna panelu NCI-60 umożliwia stratyfikację linii komórkowych według statusu mutacji w celu przeprowadzenia badań porównawczych. Linie komórkowe posiadające określone mutacje są porównywane z liniami typu dzikiego w celu identyfikacji genów selektywnie istotnych w kontekście mutacji. To izogeniczne porównanie w zróżnicowanym genetycznie panelu identyfikuje silne syntetyczne śmiertelne interakcje z potencjałem do zastosowania klinicznego.

Wysokowydajne technologie przesiewowe umożliwiają badanie syntetycznych śmiertelnych interakcji w skali genomu. Biblioteki siRNA i shRNA ukierunkowane na wszystkie ludzkie geny systematycznie identyfikują geny niezbędne do przeżycia komórek nowotworowych. Ekrany nokautujące CRISPR-Cas9 zapewniają większą precyzję i zmniejszają efekty poza celem, które komplikowały wcześniejsze podejścia RNAi. Obie technologie zostały z powodzeniem wdrożone w liniach komórkowych panelu NCI.

Paradygmat syntetycznej letalności BRCA-PARP

Syntetyczna śmiertelna interakcja między utratą BRCA1/2 a hamowaniem PARP jest przykładem udanego przełożenia badań przesiewowych linii komórkowych na zatwierdzone terapie przeciwnowotworowe. Komórki z niedoborem BRCA, niezdolne do naprawy homologicznej rekombinacji DNA, zależą od naprawy wycinania zasad za pośrednictwem PARP. Hamowanie PARP w zmutowanych komórkach BRCA powoduje akumulację uszkodzeń DNA i śmierć komórek.

Panelowe linie komórkowe NCI odegrały kluczową rolę w walidacji syntetycznej letalności BRCA-PARP i scharakteryzowaniu czynników determinujących wrażliwość na inhibitory PARP. Oprócz mutacji BRCA w linii zarodkowej, mutacje somatyczne i epigenetyczne wyciszenie genów rekombinacji homologicznej tworzą fenotypy "BRCAness", które przewidują odpowiedź na inhibitor PARP. Badania przesiewowe linii komórkowych zidentyfikowały te alternatywne defekty, rozszerzając populację potencjalnie korzystającą z inhibicji PARP.

Komórki HCT116 z niedoborem MLH1 zapewniają modele MSI-high do oceny inhibitorów szlaku naprawy DNA. Izogeniczne pary linii komórkowych ze zdefiniowanymi modyfikacjami genetycznymi umożliwiają kontrolowaną walidację syntetycznej letalności. Komórki DLD-1 i SW620 zapewniają dodatkowe modele raka jelita grubego o różnym statusie szlaku naprawy DNA.

Badania przesiewowe całego genomu oparte na CRISPR

Technologia CRISPR-Cas9 zrewolucjonizowała badania przesiewowe syntetycznej letalności, umożliwiając precyzyjne znokautowanie genów przy minimalnych efektach poza celem. Biblioteki CRISPR obejmujące cały genom, zawierające przewodniki RNA ukierunkowane na wszystkie ludzkie geny, są dostarczane do populacji linii komórkowych, a zubożenie przewodników w czasie identyfikuje geny niezbędne do przeżycia komórek. Porównawcze badania przesiewowe w liniach komórkowych panelu NCI identyfikują zależne od kontekstu istotne geny reprezentujące syntetyczne śmiertelne interakcje.

W ramach Projektu Achilles i powiązanych inicjatyw przeprowadzono systematyczne badania przesiewowe CRISPR na setkach linii komórek nowotworowych, w tym członków NCI-60. Uzyskane mapy zależności ujawniają wspólne niezbędne geny wymagane przez wszystkie komórki nowotworowe oraz zależności kontekstowe związane z określonymi mutacjami. Zasób ten umożliwia poszukiwanie syntetycznych śmiertelnych interakcji bez przeprowadzania nowych badań przesiewowych.

Linie komórkowe z mutacją KRAS wykazują zależności od członków szlaku KRAS, które potencjalnie mogą być celem syntetycznych metod letalności. Komórki A549 z mutacją KRAS G12S wykazują zależność od składników szlaku SHP2, RAF i MEK. Komórki NCI-H358 z KRAS G12C umożliwiają ocenę interakcji syntetycznej letalności specyficznej dla allelu. Komórki NCI-H460 zapewniają dodatkowe modele wielkokomórkowego raka płuc z mutacją KRAS.

Obliczeniowe metody przewidywania

Wielkoskalowe, wieloomowe zbiory danych generowane z paneli NCI umożliwiają obliczeniowe przewidywanie syntetycznych śmiertelnych interakcji. Algorytmy uczenia maszynowego wyszkolone na znanych syntetycznych parach letalnych identyfikują cechy predykcyjne interakcji genetycznych. Te podejścia obliczeniowe nadają priorytet interakcjom kandydującym do walidacji eksperymentalnej, zmniejszając obciążenie związane z badaniem każdej możliwej kombinacji genów.

Analiza korelacji ekspresji genów identyfikuje geny współeksprymowane w liniach komórkowych NCI-60, sugerując zależności funkcjonalne. Przeciwnie skorelowane wzorce ekspresji mogą wskazywać na syntetyczne śmiertelne relacje, w których kompensacja występuje na poziomie ekspresji. Integracja danych dotyczących ekspresji z sieciami interakcji genetycznych z organizmów modelowych przenosi wiedzę na kontekst nowotworów u ludzi.

Analiza na poziomie ścieżek grupuje syntetyczne śmiertelne interakcje według kategorii funkcjonalnych. Odpowiedź na uszkodzenia DNA, regulacja cyklu komórkowego i szlaki metaboliczne są wzbogacone o syntetyczne śmiertelne interakcje, które można wykorzystać terapeutycznie. Ta perspektywa ścieżek ukierunkowuje wybór celu na interakcje z wieloma węzłami, które można leczyć.

Uzależnienie od onkogenów i syntetyczna letalność

Uzależnienie od onkogenów stanowi szczególny przypadek syntetycznej letalności, w którym komórki nowotworowe zależą od ciągłej aktywności onkogenów. Wycofanie sygnalizacji onkogennej za pomocą środków genetycznych lub farmakologicznych powoduje śmierć komórki pomimo obecności innych mutacji. Badanie panelowe NCI identyfikuje geny wymagane szczególnie w kontekście onkogenów.

Linie komórkowe napędzane MYC w NCI-60 wykazują zależność od regulowanych przez MYC programów metabolicznych i biosyntetycznych. Podczas gdy sam MYC pozostaje trudny do bezpośredniego ukierunkowania, syntetyczni śmiertelni partnerzy, w tym CDK9, AURKA i enzymy metaboliczne, zapewniają alternatywne punkty interwencji. Badania przesiewowe na liniach komórkowych z amplifikacją MYC i diploidalnych identyfikują te docelowe zależności.

Komórki K562 napędzane przez BCR-ABL wykazują głębokie uzależnienie od onkogenów wykorzystywane przez imatynib i pokrewne TKI. Model ten umożliwia badanie mechanizmów utrzymujących uzależnienie od onkogenów i strategii przezwyciężania nabytej oporności. Komórki HL-60 zapewniają modele ostrej białaczki szpikowej z amplifikacją MYC do badań nad syntetyczną letalnością.

Walidacja i tłumaczenie kliniczne

Syntetyczne śmiertelne interakcje zidentyfikowane w badaniach przesiewowych panelu NCI wymagają rygorystycznej walidacji przed przełożeniem na zastosowania kliniczne. Niezależne potwierdzenie przy użyciu ortogonalnych metod (różne odczynniki RNAi, CRISPR, małe cząsteczki) zapewnia solidność. Walidacja na wielu liniach komórkowych ze wspólnymi mutacjami wykazuje możliwość uogólnienia poza kontekst poszczególnych linii komórkowych.

Modele ksenograftów pochodzących od pacjentów (PDX) zapewniają klinicznie istotne konteksty dla walidacji syntetycznej letalności. Kombinacje leków wykorzystujące syntetyczne śmiertelne interakcje są oceniane w modelach PDX pochodzących od pacjentów z odpowiednimi mutacjami. Ta etapowa walidacja zwiększa zaufanie do translacji klinicznej poprzez wykazanie aktywności w modelach zachowujących heterogeniczność guza pacjenta.

Zapewnienie jakości gwarantuje wiarygodne wyniki badań przesiewowych. Uwierzytelnianie linii komórkowej potwierdza tożsamość linii komórkowej, co ma zasadnicze znaczenie, biorąc pod uwagę udokumentowane kwestie błędnej identyfikacji. Testy na obecność mykoplazmy utrzymują integralność hodowli podczas kampanii przesiewowych. Podłoże RPMI 1640 i DMEM zapewniają znormalizowane warunki hodowli w celu uzyskania spójnych wyników badań przesiewowych.

Pojawiające się syntetyczne cele śmiertelne

Oprócz inhibitorów PARP, w fazie rozwoju klinicznego znajduje się wiele syntetycznych strategii terapeutycznych. Nowotwory z mutacją ARID1A wykazują syntetyczną letalność przy hamowaniu EZH2, co prowadzi do rozwoju tazemetostatu w mięsaku nabłonkowatym i chłoniaku grudkowym. Inhibitory ATR i CHK1 wykorzystują syntetyczną letalność w nowotworach z niedoborem ATM, które nie są w stanie aktywować alternatywnych punktów kontrolnych uszkodzeń DNA.

Syntetyczna śmiertelność metaboliczna jest ukierunkowana na specyficzne dla nowotworów zależności metaboliczne. Nowotwory z określoną aktywacją onkogenu lub utratą supresora nowotworu wykazują zmienione wykorzystanie szlaków metabolicznych, co stwarza podatność na leki. Dane metabolomiczne panelu NCI i dane dotyczące wrażliwości na leki informują o identyfikacji metabolicznych interakcji syntetycznej letalności.

Syntetyczna letalność w immunoterapii reprezentuje wyłaniającą się koncepcję, w której zmiany genetyczne przewidują odpowiedź na inhibitory immunologicznego punktu kontrolnego. Utrata genów maszynerii prezentacji antygenu powoduje zależność od inhibicji punktów kontrolnych w celu uniknięcia odpowiedzi immunologicznej. Charakterystyka panelu NCI ekspresji genów związanych z odpornością pozwala przewidzieć syntetyczną letalność immunoterapii.

Wnioski

Panele linii komórek nowotworowych NCI zapewniają niezbędne platformy do systematycznej identyfikacji i walidacji syntetycznych śmiertelnych interakcji. Sukces syntetycznej letalności BRCA-PARP pokazuje potencjał translacyjny odkryć opartych na liniach komórkowych. Postępy w technologii przesiewowej CRISPR i obliczeniowych metodach przewidywania nadal poszerzają katalog możliwych do zastosowania syntetycznych śmiertelnych interakcji. Integracja danych przesiewowych z walidacją kliniczną w modelach pochodzących od pacjentów przyspiesza przełożenie odkryć syntetycznej letalności na lepsze leczenie raka.