Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

NCI paneļu izmantošana sintētiskās letalitātes skrīningam

Sintētiskais letālisms ir spēcīga terapeitiskā stratēģija, kas izmanto vēža šūnām raksturīgās ģenētiskās ievainojamības, vienlaikus saudzējot normālos audus. Ja viena gēna zudums rada atkarību no otra gēna šūnu izdzīvošanai, otrā gēna inhibēšana selektīvi nogalina vēža šūnas, kurās ir pirmā mutācija. NCI-60 un saistīto vēža šūnu līniju paneļi ar visaptverošu genomu raksturojumu un augstas veiktspējas skrīninga infrastruktūru ir ideālas platformas sistemātiskai sintētisko letālo mijiedarbību identificēšanai, kas piemērojamas precīzijas onkoloģijā.

Galvenie secinājumi

• NCI vēža šūnu līniju paneļi ļauj veikt genoma mēroga sintētiskās letalitātes skrīningus, izmantojot siRNA, shRNA un CRISPR bibliotēkas
• Skrīninga datu integrācija ar genoma anotācijām identificē genotipam specifiskas atkarības, kas izmantojamas terapeitiski
• BRCA1/2-PARP inhibitoru sintētiskā letalitāte ir veiksmīgas šūnu līniju ekrānu klīniskās izmantošanas piemērs
• Funkcijas zuduma ekrāni paneļos ar noteiktām mutācijām identificē no konteksta atkarīgus būtiskus gēnus
• Datoriskas pieejas paredz sintētiskās letālās mijiedarbības no NCI paneļa multikomponentu datiem

Sintētiskās letalitātes skrīninga principi

Sintētiskais letālisms rodas, ja divu gēnu vienlaicīga zaudēšana izraisa šūnu nāvi, bet viena gēna zaudēšana tiek paciesta. Vēža gadījumā audzēja specifiskas mutācijas rada atkarību no partnergēniem, kas kļūst par terapeitiskiem mērķiem. Inhibējot šos partnergēnus, selektīvi tiek nogalinātas vēža šūnas, kurās ir sensitīvā mutācija, vienlaikus saudzējot normālas šūnas ar neskartiem kompensējošiem ceļiem.

NCI-60 paneļa visaptverošā genoma anotācija ļauj stratificēt šūnu līnijas pēc mutācijas statusa salīdzinošai skrīninga pārbaudei. Šūnu līnijas, kurās ir konkrētas interesējošas mutācijas, tiek salīdzinātas ar savvaļas tipa līnijām, lai identificētu gēnus, kas ir selektīvi būtiski mutācijas kontekstā. Šis izogēniski līdzīgais salīdzinājums ģenētiski daudzveidīgā panelī identificē stabilas sintētiskas letālas mijiedarbības ar potenciālu klīniskai izmantošanai.

Augstas veiktspējas skrīninga tehnoloģijas ļauj veikt sintētisko letālo mijiedarbību izpēti genoma mērogā. siRNA un shRNA bibliotēkas, kas mērķētas uz visiem cilvēka gēniem, sistemātiski identificē vēža šūnu izdzīvošanai būtiskus gēnus. CRISPR-Cas9 knockout skrīni nodrošina lielāku precizitāti un mazina blakusmērķa iedarbību, kas sarežģīja iepriekšējās RNAi pieejas. Abas tehnoloģijas ir veiksmīgi izmantotas NCI paneļa šūnu līnijās.

BRCA-PARP sintētiskā letalitātes paradigma

Sintētiskā letālā mijiedarbība starp BRCA1/2 zudumu un PARP inhibīciju ir piemērs veiksmīgai pārejai no šūnu līniju ekrāniem uz apstiprinātām vēža terapijām. BRCA deficīta šūnas, kas nespēj veikt homologās rekombinācijas DNS labošanu, izdzīvošanas nodrošināšanai ir atkarīgas no PARP mediētās bāzes ekscīzijas labošanas. PARP inhibīcija BRCA-mutantu šūnās izraisa DNS bojājumu uzkrāšanos un šūnu nāvi.

NCI paneļa šūnu līnijas bija noderīgas, lai apstiprinātu BRCA-PARP sintētisko letalitāti un raksturotu PARP inhibitoru jutības faktorus. Papildus dzimumlīnijas BRCA mutācijām somatiskās mutācijas un homoloģiskās rekombinācijas gēnu epigenētiskā slāpēšana rada "BRCAness" fenotipus, kas paredz PARP inhibitora atbildes reakciju. Šūnu līniju skrīnings identificēja šos alternatīvos defektus, paplašinot populāciju, kas potenciāli gūst labumu no PARP inhibīcijas.

HCT116 šūnas ar MLH1 deficītu ir MSI augsts modelis DNS atjaunošanas ceļa inhibitoru novērtēšanai. Izogēno šūnu līniju pāri ar noteiktām ģenētiskām modifikācijām ļauj veikt kontrolētu sintētiskās letalitātes validāciju. DLD-1 šūnas un SW620 šūnas ir papildu kolorektālā vēža modeļi ar atšķirīgu DNS labošanas ceļa statusu.

Uz CRISPR balstīts genoma skrīnings

CRISPR-Cas9 tehnoloģija ir revolucionizējusi sintētiskās letalitātes skrīningu, ļaujot precīzi izslēgt gēnus ar minimālu blakusmērķa ietekmi. Šūnu līniju populācijām tiek piegādātas genoma CRISPR bibliotēkas, kas satur vadošo RNS, kuras ir vērstas uz visiem cilvēka gēniem, un vadošo RNS noplicināšana laika gaitā identificē gēnus, kas ir būtiski šūnu izdzīvošanai. Salīdzinošā skrīningā NCI paneļa šūnu līnijās identificē no konteksta atkarīgus būtiskus gēnus, kas pārstāv sintētiskas letālas mijiedarbības.

Projektā Achilles un saistītās iniciatīvās ir veikti sistemātiski CRISPR skrīningi simtiem vēža šūnu līniju, tostarp NCI-60 locekļiem. Rezultātā iegūtās atkarību kartes atklāj kopīgus būtiskus gēnus, kas nepieciešami visām vēža šūnām, un kontekstam specifiskas atkarības, kas saistītas ar konkrētām mutācijām. Šis resurss ļauj atrast sintētiskas letālas mijiedarbības, neveicot jaunus skrīningus.

Šūnu līnijas ar KRAS mutāciju liecina par atkarību no KRAS ceļa locekļiem, uz kuriem potenciāli var iedarboties, izmantojot sintētiskās letalitātes pieejas. A549 Šūnas, kurās ir KRAS G12S mutācijas, uzrāda atkarību no SHP2, RAF un MEK ceļa sastāvdaļām. NCI-H358 šūnas ar KRAS G12C ļauj novērtēt alēlei specifiskas sintētiskas letālas mijiedarbības. NCI-H460 šūnas nodrošina papildu KRAS mutantu lielšūnu plaušu karcinomas modeļus.

Datorizētas prognozēšanas pieejas

Liela mēroga multikomponentu datu kopas, kas iegūtas no NCI paneļiem, ļauj ar skaitļošanas metodēm prognozēt sintētiskas letālas mijiedarbības. Mašīnmācīšanās algoritmi, kas apmācīti, izmantojot zināmus sintētiskus letālus pārus, identificē pazīmes, kas ļauj prognozēt ģenētiskās mijiedarbības. Šīs skaitļošanas pieejas prioritizē kandidātu mijiedarbības eksperimentālai apstiprināšanai, samazinot slogu, kas saistīts ar katras iespējamās gēnu kombinācijas pārbaudi.

Gēnu ekspresijas korelācijas analīze identificē gēnus, kas līdzīgi ekspresēti NCI-60 šūnu līnijās, norādot uz funkcionālām attiecībām. Pretkorelācijas ekspresijas modeļi var norādīt uz sintētiskām letālām attiecībām, kur kompensācija notiek ekspresijas līmenī. Ekspresijas datu integrācija ar ģenētiskās mijiedarbības tīkliem no modeļorganismiem pārnes zināšanas uz cilvēka vēža kontekstu.

Ceļu līmeņa analīze grupē sintētiskās letālās mijiedarbības pēc funkcionālām kategorijām. DNS bojājumu reakcija, šūnu cikla regulācija un metabolisma ceļi ir bagātināti ar sintētiskām letālām mijiedarbībām, ko var izmantot terapeitiski. Šī ceļu perspektīva virza mērķa atlasi uz mijiedarbībām ar vairākiem zāļu iedarbības mezgliem.

Onkogēnu atkarība un sintētiskā letalitāte

Onkogēnu atkarība ir īpašs sintētiskā letālisma gadījums, kad vēža šūnas ir atkarīgas no vadošo onkogēnu nepārtrauktas darbības. Onkogēnu signalizācijas pārtraukšana ar ģenētiskiem vai farmakoloģiskiem līdzekļiem izraisa šūnu nāvi, neraugoties uz citu mutāciju klātbūtni. NCI paneļa skrīnings identificē gēnus, kas īpaši nepieciešami onkogēnu vadītājfaktoru kontekstā.

MYC vadītās šūnu līnijas NCI-60 ietvaros uzrāda atkarību no MYC regulētām metabolisma un biosintēzes programmām. Lai gan pašu MYC joprojām ir grūti tieši ietekmēt, sintētiskie letālie partneri, tostarp CDK9, AURKA un metabolisma enzīmi, nodrošina alternatīvus intervences punktus. MYC amplificēto šūnu līniju skrīnings salīdzinājumā ar diploīdu šūnu līnijām identificē šīs mērķtiecīgās atkarības.

K562 BCR-ABL vadītāsšūnas demonstrē dziļu onkogēna atkarību, ko izmanto imatinibs un saistītie TKI. Šis modelis ļauj izpētīt onkogēna atkarības uzturēšanas mehānismus un iegūtās rezistences pārvarēšanas stratēģijas. HL-60 šūnas nodrošina MYC amplificētas akūtas mieloīdās leikēmijas modeļus sintētiskās letalitātes pētījumiem.

Apstiprināšana un klīniskā izmantošana

Sintētiskās letālās mijiedarbības, kas identificētas, izmantojot NCI paneļa skrīningu, pirms klīniskās izmantošanas ir rūpīgi jāapstiprina. Neatkarīgs apstiprinājums, izmantojot ortogonālas metodes (dažādi RNNAi reaģenti, CRISPR, mazas molekulas), nodrošina stabilitāti. Apstiprināšana vairākās šūnu līnijās ar kopīgām mutācijām pierāda vispārināmību ārpus atsevišķu šūnu līniju konteksta.

No pacientiem iegūtu ksenotaugu (PDX) modeļi nodrošina klīniski atbilstošu kontekstu sintētiskās letalitātes validācijai. Zāļu kombinācijas, kurās izmanto sintētiskās letālās mijiedarbības, tiek novērtētas PDX modeļos, kas iegūti no pacientiem ar attiecīgām mutācijām. Šī pakāpeniskā validācija palielina pārliecību par klīnisko pielietojumu, demonstrējot aktivitāti modeļos, kas saglabā pacientu audzēju heterogenitāti.

Kvalitātes nodrošināšana nodrošina uzticamus skrīninga rezultātus. Šūnu līnijas autentifikācija apstiprina šūnu līnijas identitāti, kas ir būtiski, ņemot vērā dokumentētās nepareizas identifikācijas problēmas. Mikoplazmas testēšana nodrošina kultūru integritāti skrīninga kampaņu laikā. RPMI 1640 barotne un DMEM nodrošina standartizētus kultivēšanas apstākļus konsekventiem skrīninga rezultātiem.

Jaunie sintētiskie letālie mērķi

Papildus PARP inhibitoriem klīniskajā izstrādē tiek attīstītas vairākas sintētiskās letālās terapeitiskās stratēģijas. ARID1A-mutantu vēzis uzrāda sintētisku letalitāti ar EZH2 inhibīciju, kā rezultātā tiek izstrādāts tazemetostats epitēlioīdās sarkomas un folikulārās limfomas ārstēšanai. ATR un CHK1 inhibitori izmanto sintētisko letalitāti ATM deficīta vēža formās, kas nespēj aktivizēt alternatīvos DNS bojājumu kontrolpunktus.

Sintētiskā metaboliskā letalitāte ir vērsta pret vēža specifiskām metaboliskām atkarībām. Audzēji ar specifisku onkogēna aktivizāciju vai audzēja supresora zudumu uzrāda izmainītu metabolisma ceļu izmantošanu, kas rada zāļu ievainojamību. NCI paneļa metabolomikas un zāļu jutības dati sniedz informāciju par metaboliskās sintētiskās letalitātes mijiedarbības identificēšanu.

Imūnterapijas sintētiskais letālisms ir jauns koncepts, kurā ģenētiskās izmaiņas paredz atbildes reakciju uz imūnās kontroles punktu inhibitoriem. Antigēnu prezentācijas mehānisma gēnu zudums rada atkarību no kontrolpunktu inhibīcijas, lai izvairītos no imūnās iedarbības. Ar imūnsistēmu saistīto gēnu ekspresijas raksturojums NCI panelī palīdz prognozēt imūnterapijas sintētisko letalitāti.

Secinājumi

NCI vēža šūnu līniju paneļi nodrošina būtiskas platformas sistemātiskai sintētiskās letālās mijiedarbības identificēšanai un apstiprināšanai. BRCA-PARP sintētiskās letalitātes panākumi liecina par šūnu līnijās balstītas atklāšanas potenciālu. Sasniegumi CRISPR skrīninga tehnoloģijā un skaitļošanas prognozēšanas pieejās turpina paplašināt izmantojamo sintētisko letālo mijiedarbību katalogu. Skrīninga datu integrācija ar klīnisko validāciju no pacientiem atvasinātos modeļos paātrina sintētiskās letalitātes atklājumu izmantošanu, lai uzlabotu vēža ārstēšanu.