Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

Utilização dos painéis da NCI para o rastreio da letalidade sintética

A letalidade sintética representa uma estratégia terapêutica poderosa que explora vulnerabilidades genéticas específicas das células cancerígenas, poupando os tecidos normais. Quando a perda de um gene cria a dependência de um segundo gene para a sobrevivência da célula, a inibição do segundo gene mata seletivamente as células cancerosas que possuem a primeira mutação. O NCI-60 e os painéis de linhas de células cancerígenas relacionadas, com uma caraterização genómica abrangente e uma infraestrutura de rastreio de elevado rendimento, constituem plataformas ideais para a identificação sistemática de interações letais sintéticas aplicáveis à oncologia de precisão.

Principais conclusões

• Os painéis de linhas celulares de cancro da NCI permitem rastreios de letalidade sintética à escala do genoma utilizando bibliotecas de siRNA, shRNA e CRISPR
• A integração de dados de rastreio com anotações genómicas identifica dependências específicas do genótipo que podem ser exploradas terapeuticamente
• A letalidade sintética do inibidor BRCA1/2-PARP é um exemplo de tradução clínica bem sucedida a partir de rastreios de linhas celulares
• Os rastreios de perda de função em painéis com mutações definidas identificam genes essenciais dependentes do contexto
• Abordagens computacionais prevêem interações letais sintéticas a partir de dados multi-ómicos de painéis NCI

Princípios do rastreio da letalidade sintética

A letalidade sintética ocorre quando a perda simultânea de dois genes causa a morte celular, enquanto a perda de um dos genes isoladamente é tolerada. No cancro, as mutações específicas do tumor criam dependências em genes parceiros que se tornam alvos terapêuticos. A inibição destes genes parceiros mata seletivamente as células cancerígenas que possuem a mutação sensibilizadora, poupando as células normais com vias compensatórias intactas.

A anotação genómica exaustiva do painel NCI-60 permite a estratificação das linhas celulares por estado de mutação para um rastreio comparativo. As linhas celulares com mutações específicas de interesse são comparadas com linhas de tipo selvagem para identificar genes seletivamente essenciais no contexto mutante. Esta comparação isogénica através de um painel geneticamente diverso identifica interações letais sintéticas robustas com potencial para tradução clínica.

As tecnologias de rastreio de elevado rendimento permitem a interrogação à escala do genoma das interações letais sintéticas. As bibliotecas de siRNA e shRNA que visam todos os genes humanos identificam sistematicamente genes essenciais para a sobrevivência das células cancerígenas. Os rastreios de knockout CRISPR-Cas9 permitem uma maior precisão e reduzem os efeitos fora do alvo que complicavam as abordagens anteriores de RNAi. Ambas as tecnologias foram utilizadas com sucesso em linhas celulares do painel NCI.

Paradigma da letalidade sintética BRCA-PARP

A interação letal sintética entre a perda de BRCA1/2 e a inibição da PARP é um exemplo de uma transposição bem sucedida dos rastreios de linhas celulares para terapias aprovadas contra o cancro. As células deficientes em BRCA, incapazes de efetuar a reparação do ADN por recombinação homóloga, dependem da reparação por excisão de bases mediada por PARP para sobreviver. A inibição da PARP nas células BRCA-mutantes provoca a acumulação de danos no ADN e a morte celular.

As linhas celulares do painel NCI foram fundamentais para validar a letalidade sintética BRCA-PARP e caraterizar os factores determinantes da sensibilidade dos inibidores da PARP. Para além das mutações BRCA da linha germinal, as mutações somáticas e o silenciamento epigenético dos genes de recombinação homóloga criam fenótipos de "BRCAness" que prevêem a resposta aos inibidores da PARP. O rastreio de linhas celulares identificou estes defeitos alternativos, expandindo a população que potencialmente beneficia da inibição da PARP.

As células HCT116 com deficiência de MLH1 fornecem modelos MSI-alto para avaliar os inibidores da via de reparação do ADN. Os pares de linhas celulares isogénicas com modificações genéticas definidas permitem a validação da letalidade sintética controlada. As células DLD-1 e SW620 contribuem com modelos adicionais de cancro colorrectal com estado distinto da via de reparação do ADN.

Rastreio de todo o genoma com base em CRISPR

A tecnologia CRISPR-Cas9 revolucionou o rastreio da letalidade sintética ao permitir a eliminação precisa de genes com efeitos mínimos fora do alvo. As bibliotecas CRISPR de todo o genoma que contêm RNAs-guia que visam todos os genes humanos são entregues a populações de linhas celulares, e a depleção de guias ao longo do tempo identifica genes essenciais para a sobrevivência das células. O rastreio comparativo das linhas celulares do painel NCI identifica genes essenciais dependentes do contexto que representam interações letais sintéticas.

O Projeto Achilles e iniciativas relacionadas realizaram rastreios CRISPR sistemáticos em centenas de linhas celulares de cancro, incluindo membros do painel NCI-60. Os mapas de dependência resultantes revelam genes essenciais comuns exigidos por todas as células cancerígenas e dependências específicas do contexto associadas a mutações particulares. Este recurso permite a pesquisa de interações letais sintéticas sem a realização de novos rastreios.

As linhas celulares com mutações KRAS demonstram dependências em relação a membros da via KRAS potencialmente visáveis através de abordagens de letalidade sintética. As células A549 com mutações KRAS G12S mostram dependência dos componentes das vias SHP2, RAF e MEK. As células NCI-H358 com KRAS G12C permitem a avaliação de interações letais sintéticas específicas do alelo. As células NCI-H460 fornecem modelos adicionais de carcinoma pulmonar de células grandes com mutação KRAS.

Abordagens de previsão computacional

Os conjuntos de dados multi-ómicos em grande escala gerados a partir de painéis NCI permitem a previsão computacional de interações letais sintéticas. Os algoritmos de aprendizagem automática treinados em pares letais sintéticos conhecidos identificam caraterísticas preditivas de interações genéticas. Estas abordagens computacionais dão prioridade às interações candidatas para validação experimental, reduzindo o ónus de rastreio de todas as combinações de genes possíveis.

A análise da correlação da expressão genética identifica genes co-expressos nas linhas celulares NCI-60, sugerindo relações funcionais. Os padrões de expressão anti-correlacionados podem indicar relações letais sintéticas em que a compensação ocorre ao nível da expressão. A integração de dados de expressão com redes de interação genética de organismos modelo transfere o conhecimento para contextos de cancro humano.

A análise ao nível das vias agrupa as interações letais sintéticas por categorias funcionais. A resposta aos danos no ADN, a regulação do ciclo celular e as vias metabólicas são enriquecidas por interações letais sintéticas exploráveis terapeuticamente. Esta perspetiva de via orienta a seleção de alvos para interações com múltiplos nós farmacológicos.

Dependência de oncogenes e letalidade sintética

A dependência de oncogenes representa um caso especial de letalidade sintética em que as células cancerígenas dependem da atividade continuada de oncogenes condutores. A interrupção da sinalização oncogénica através de meios genéticos ou farmacológicos provoca a morte celular, apesar da presença de outras mutações. O rastreio do painel da NCI identifica os genes necessários especificamente em contextos de oncogenes.

As linhas de células com MYC no NCI-60 demonstram dependências de programas metabólicos e biossintéticos regulados por MYC. Embora seja difícil atingir diretamente o MYC, os parceiros letais sintéticos, incluindo CDK9, AURKA e enzimas metabólicas, proporcionam pontos de intervenção alternativos. O rastreio de linhas de células amplificadas por MYC versus linhas de células diplóides identifica estas dependências visíveis.

As células K562 impulsionadas por BCR-ABL demonstram uma profunda dependência do oncogene explorada pelo imatinib e por TKIs relacionados. Este modelo permite investigar os mecanismos que mantêm a dependência do oncogene e as estratégias para ultrapassar a resistência adquirida. As células HL-60 fornecem modelos de leucemia mieloide aguda amplificada por MYC para estudos de letalidade sintética.

Validação e tradução clínica

As interações letais sintéticas identificadas através do rastreio do painel NCI requerem uma validação rigorosa antes da tradução clínica. A confirmação independente utilizando métodos ortogonais (diferentes reagentes RNAi, CRISPR, pequenas moléculas) estabelece a robustez. A validação em várias linhas celulares com mutações partilhadas demonstra a generalização para além dos contextos de linhas celulares individuais.

Os modelos de xenoenxertos derivados de doentes (PDX) fornecem contextos clinicamente relevantes para a validação da letalidade sintética. As combinações de medicamentos que exploram interações letais sintéticas são avaliadas em modelos PDX derivados de doentes com mutações relevantes. Esta validação faseada aumenta a confiança na tradução clínica ao demonstrar a atividade em modelos que mantêm a heterogeneidade do tumor do doente.

A garantia de qualidade assegura resultados de rastreio fiáveis. A autenticação da linha celular confirma a identidade da linha celular, essencial devido a problemas documentados de identificação incorrecta. O teste de micoplasma mantém a integridade da cultura durante as campanhas de rastreio. Os meios RPMI 1640 e DMEM fornecem condições de cultura padronizadas para resultados de rastreio consistentes.

Alvos letais sintéticos emergentes

Para além dos inibidores PARP, várias estratégias terapêuticas letais sintéticas estão a avançar através do desenvolvimento clínico. Os cancros com mutações ARID1A demonstram letalidade sintética com a inibição de EZH2, levando ao desenvolvimento de tazemetostat para o sarcoma epitelioide e o linfoma folicular. Os inibidores de ATR e CHK1 exploram a letalidade sintética em cancros deficientes em ATM, incapazes de ativar pontos de verificação alternativos dos danos no ADN.

A letalidade sintética metabólica visa as dependências metabólicas específicas do cancro. Os tumores com ativação específica de oncogenes ou perda de supressores tumorais demonstram uma utilização alterada da via metabólica que cria vulnerabilidades passíveis de serem tratadas com medicamentos. Os dados metabolómicos e de sensibilidade aos fármacos do painel NCI permitem a identificação de interações metabólicas letais sintéticas.

A letalidade sintética da imunoterapia representa um conceito emergente em que as alterações genéticas prevêem a resposta aos inibidores do ponto de controlo imunitário. A perda de genes da maquinaria de apresentação de antigénios cria uma dependência da inibição dos pontos de controlo para a evasão imunitária. A caraterização do painel NCI da expressão de genes relacionados com o sistema imunitário informa a previsão da letalidade sintética da imunoterapia.

Conclusão

Os painéis de linhas celulares de cancro da NCI fornecem plataformas essenciais para a identificação e validação sistemáticas de interações letais sintéticas. O sucesso da letalidade sintética BRCA-PARP demonstra o potencial translacional da descoberta baseada em linhas celulares. Os avanços na tecnologia de rastreio CRISPR e as abordagens de previsão computacional continuam a expandir o catálogo de interações letais sintéticas acionáveis. A integração de dados de rastreio com validação clínica em modelos derivados de doentes acelera a tradução das descobertas de letalidade sintética para um melhor tratamento do cancro.