Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

Використання панелей NCI для скринінгу синтетичної летальності

Синтетична летальність являє собою потужну терапевтичну стратегію, що використовує генетичні вразливості, характерні для ракових клітин, не зачіпаючи при цьому нормальні тканини. Коли втрата одного гена створює залежність від другого гена для виживання клітини, інгібування другого гена вибірково вбиває ракові клітини, що містять першу мутацію. Панелі ліній ракових клітин NCI-60 та споріднених ліній з комплексною геномною характеристикою та високопродуктивною скринінговою інфраструктурою є ідеальними платформами для систематичної ідентифікації синтетичних летальних взаємодій, що застосовуються в прецизійній онкології.

Основні висновки

• Панелі ліній ракових клітин NCI дозволяють проводити скринінг синтетичної летальності на рівні геному з використанням бібліотек siRNA, shRNA та CRISPR
• Інтеграція даних скринінгу з геномними анотаціями дозволяє виявити генотип-специфічні залежності, які можна використовувати з терапевтичною метою
• Синтетична летальність інгібітора BRCA1/2-PARP є прикладом успішної клінічної трансляції скринінгу клітинних ліній
• Скринінги втрати функції в панелях з визначеними мутаціями ідентифікують контекстно-залежні основні гени
• Обчислювальні підходи прогнозують синтетичні летальні взаємодії на основі мультиномних даних панелі NCI

Принципи скринінгу синтетичної летальності

Синтетична летальність виникає, коли одночасна втрата двох генів призводить до загибелі клітини, тоді як втрата лише одного гена є толерантною. При раку пухлиноспецифічні мутації створюють залежність від генів-партнерів, які стають терапевтичними мішенями. Інгібування цих генів-партнерів вибірково вбиває ракові клітини, що несуть сенсибілізуючу мутацію, при цьому щадить нормальні клітини з неушкодженими компенсаторними шляхами.

Комплексна геномна анотація панелі NCI-60 дозволяє стратифікувати клітинні лінії за мутаційним статусом для порівняльного скринінгу. Клітинні лінії, що містять специфічні мутації, порівнюються з лініями дикого типу для виявлення генів, вибірково важливих у мутантному контексті. Таке ізогенне порівняння генетично різноманітної панелі дозволяє виявити стійкі синтетичні летальні взаємодії з потенціалом для клінічної трансляції.

Високопродуктивні технології скринінгу дозволяють досліджувати синтетичні летальні взаємодії на рівні геному. Бібліотеки siRNA та shRNA, націлені на всі гени людини, систематично ідентифікують гени, необхідні для виживання ракових клітин. Нокаут-скрини CRISPR-Cas9 забезпечують вищу точність і зменшують кількість нецільових ефектів, які ускладнювали попередні підходи до РНКІ. Обидві технології були успішно застосовані в панельних клітинних лініях NCI.

Парадигма синтетичної летальності BRCA-PARP

Синтетична летальна взаємодія між втратою BRCA1/2 та інгібуванням PARP є прикладом успішного переходу від скринінгу клітинних ліній до затвердженої терапії раку. Клітини з дефіцитом BRCA, які не здатні здійснювати гомологічну рекомбінаційну репарацію ДНК, залежать для виживання від PARP-опосередкованої репарації висічення основ. Пригнічення PARP в BRCA-мутантних клітинах призводить до накопичення пошкоджень ДНК і загибелі клітин.

Панельні клітинні лінії NCI були важливими для підтвердження синтетичної летальності BRCA-PARP та визначення факторів, що визначають чутливість до інгібіторів PARP. Окрім мутацій BRCA в зародковій лінії, соматичні мутації та епігенетичне приглушення гомологічних генів рекомбінації створюють фенотипи "BRCAness", які передбачають відповідь на інгібітор PARP. Скринінг клітинних ліній виявив ці альтернативні дефекти, розширивши популяцію, яка потенційно виграє від інгібування PARP.

Клітини HCT116 з дефіцитом MLH1 є моделями з високим рівнем MSI для оцінки інгібіторів шляху репарації ДНК. Пари ізогенних клітинних ліній з певними генетичними модифікаціями дозволяють проводити контрольовану валідацію синтетичної летальності. Клітини DLD-1 та SW620 надають додаткові моделі колоректального раку з різним статусом шляху репарації ДНК.

Геномний скринінг на основі CRISPR

Технологія CRISPR-Cas9 зробила революцію у скринінгу синтетичної летальності, уможлививши точне нокаутування генів з мінімальними нецільовими ефектами. Геномні бібліотеки CRISPR, що містять направляючі РНК, націлені на всі гени людини, доставляються до популяцій клітинних ліній, і виснаження направляючих з часом ідентифікує гени, необхідні для виживання клітин. Порівняльний скринінг клітинних ліній панелі NCI визначає контекстно-залежні основні гени, що представляють синтетичні летальні взаємодії.

Проект Achilles та пов'язані з ним ініціативи провели систематичний CRISPR-скринінг сотень ракових клітинних ліній, у тому числі членів NCI-60. Отримані в результаті карти залежностей виявляють спільні основні гени, необхідні всім раковим клітинам, а також контекстно-специфічні залежності, пов'язані з певними мутаціями. Цей ресурс дає змогу шукати синтетичні летальні взаємодії без проведення нових скринінгів.

KRAS-мутантні клітинні лінії демонструють залежність від членів KRAS-шляху, на які потенційно можна впливати за допомогою підходів синтетичної летальності. A549 Клітини з мутаціями KRAS G12S демонструють залежність від компонентів шляху SHP2, RAF та MEK. NCI-H358 Клітини з KRAS G12C дозволяють оцінити алель-специфічні синтетичні летальні взаємодії. Клітини NCI-H460 надають додаткові моделі KRAS-мутантної великоклітинної карциноми легень.

Підходи до обчислювального прогнозування

Великомасштабні мультиомні набори даних, отримані з панелей NCI, дають змогу комп'ютерного прогнозування синтетичних летальних взаємодій. Алгоритми машинного навчання, навчені на відомих синтетичних летальних парах, визначають ознаки, що передбачають генетичні взаємодії. Ці обчислювальні підходи визначають пріоритетність взаємодій-кандидатів для експериментальної перевірки, зменшуючи тягар скринінгу кожної можливої комбінації генів.

Кореляційний аналіз експресії генів визначає гени, що коекспресуються в клітинних лініях NCI-60, що вказує на функціональні взаємозв'язки. Антикореляційні патерни експресії можуть вказувати на синтетичні летальні зв'язки, де компенсація відбувається на рівні експресії. Інтеграція даних про експресію з мережами генетичної взаємодії модельних організмів переносить знання в контекст раку людини.

Аналіз на рівні шляху групує синтетичні летальні взаємодії за функціональними категоріями. Реакція на пошкодження ДНК, регуляція клітинного циклу та метаболічні шляхи збагачуються для синтетичних летальних взаємодій, які можна використовувати з терапевтичною метою. Така перспектива спрямовує вибір мішеней на взаємодію з кількома лікарськими вузлами.

Онкогенна залежність і синтетична летальність

Онкогенна залежність являє собою особливий випадок синтетичної летальності, коли ракові клітини залежать від постійної активності онкогенів-драйверів. Припинення онкогенної сигналізації генетичним або фармакологічним шляхом призводить до загибелі клітин, незважаючи на наявність інших мутацій. Скринінг панелі NCI визначає гени, необхідні саме в контексті онкогенів, керованих онкогенами.

Клітинні лінії, керовані MYC, в рамках NCI-60 демонструють залежність від регульованих MYC метаболічних і біосинтетичних програм. Хоча сам MYC залишається складною мішенню для прямого впливу, синтетичні летальні партнери, включаючи CDK9, AURKA та метаболічні ферменти, забезпечують альтернативні точки втручання. Скринінг на ампліфікованих MYC та диплоїдних клітинних лініях дозволяє виявити ці цільові залежності.

Клітини K562, керовані BCR-ABL, демонструють глибоку онкогенну залежність, що експлуатується іматинібом та спорідненими TKI. Ця модель дозволяє дослідити механізми, що підтримують онкогенну залежність, та стратегії подолання набутої резистентності. Клітини HL-60 надають моделі гострої мієлоїдної лейкемії, підсилені MYC, для синтетичних досліджень летальності.

Валідація та клінічне застосування

Синтетичні летальні взаємодії, виявлені за допомогою скринінгу панелі NCI, потребують ретельної валідації перед клінічним перекладом. Незалежне підтвердження з використанням ортогональних методів (різні реагенти РНКІ, CRISPR, малі молекули) забезпечує надійність. Валідація на декількох клітинних лініях зі спільними мутаціями демонструє можливість узагальнення за межами контексту окремих клітинних ліній.

Моделі ксенотрансплантатів, отриманих від пацієнта (PDX), забезпечують клінічно релевантний контекст для валідації синтетичної летальності. Комбінації лікарських засобів, що використовують синтетичні летальні взаємодії, оцінюються на моделях PDX, отриманих від пацієнтів з відповідними мутаціями. Така поетапна валідація підвищує довіру до клінічної трансляції, демонструючи активність на моделях, що підтримують гетерогенність пухлин пацієнтів.

Забезпечення якості гарантує надійність результатів скринінгу. Аутентифікація клітинних ліній підтверджує ідентичність клітинних ліній, що важливо з огляду на задокументовані проблеми з помилковою ідентифікацією. Тестування на мікоплазму підтримує цілісність культури протягом скринінгових кампаній. Середовище RPMI 1640 і DMEM забезпечують стандартизовані умови культивування для отримання послідовних результатів скринінгу.

Нові синтетичні летальні мішені

Окрім інгібіторів PARP, у клінічних дослідженнях просуваються численні синтетичні летальні терапевтичні стратегії. ARID1A-мутантні раки демонструють синтетичну летальність при інгібуванні EZH2, що призвело до розробки таземетостату для лікування епітеліоїдної саркоми та фолікулярної лімфоми. Інгібітори ATR та CHK1 використовують синтетичну летальність в АТМ-дефіцитних раках, які не здатні активувати альтернативні контрольні точки пошкодження ДНК.

Метаболічна синтетична летальність націлена на раково-специфічні метаболічні залежності. Пухлини зі специфічною активацією онкогенів або втратою пухлинних супресорів демонструють змінений метаболічний шлях, що створює вразливість до лікарських препаратів. Дані метаболомічного аналізу панелі NCI та чутливості до лікарських препаратів допомагають ідентифікувати метаболічні синтетичні летальні взаємодії.

Синтетична летальність в імунотерапії - це нова концепція, в якій генетичні зміни передбачають реакцію на інгібітори імунних контрольних точок. Втрата генів механізмів презентації антигенів створює залежність від інгібування контрольних точок для уникнення імунітету. Панель NCI характеризує експресію генів, пов'язаних з імунітетом, для прогнозування синтетичної летальності при імунотерапії.

Висновок

Панелі клітинних ліній раку NCI є важливими платформами для систематичної ідентифікації та валідації синтетичних летальних взаємодій. Успіх синтетичної летальності BRCA-PARP демонструє трансляційний потенціал відкриттів на основі клітинних ліній. Досягнення в технології скринінгу CRISPR та комп'ютерних підходах до прогнозування продовжують розширювати каталог дієвих синтетичних летальних взаємодій. Інтеграція даних скринінгу з клінічною перевіркою на моделях, отриманих на пацієнтах, прискорює перетворення відкриттів синтетичної летальності на покращене лікування раку.