Using NCI Panels for Synthetic Lethality Screening

Използване на панелите на NCI за скрининг на синтетична смъртност

Синтетичният леталитет представлява мощна терапевтична стратегия, която използва генетични уязвимости, специфични за раковите клетки, като същевременно щади нормалните тъкани. Когато загубата на един ген създава зависимост от втори ген за оцеляването на клетката, инхибирането на втория ген селективно убива раковите клетки, които са носители на първата мутация. Панелите на NCI-60 и свързаните с тях ракови клетъчни линии, с цялостна геномна характеристика и инфраструктура за високопроизводителен скрининг, осигуряват идеални платформи за систематично идентифициране на синтетични смъртоносни взаимодействия, приложими в прецизната онкология.

Основни изводи

• Панелите от ракови клетъчни линии NCI позволяват провеждането на скрининги за синтетична леталност в геномен мащаб с помощта на библиотеки от siRNA, shRNA и CRISPR
• Интегрирането на данните от скрининга с геномни анотации идентифицира специфични за генотипа зависимости, които могат да се използват терапевтично
• Синтетичният леталитет на BRCA1/2-PARP инхибитора е пример за успешно клинично приложение на скрининги на клетъчни линии
• Скрининги за загуба на функции в панели с определени мутации идентифицират зависими от контекста съществени гени
• Компютърни подходи за предсказване на синтетични летални взаимодействия от мултиомични данни от панел на NCI

Принципи на скрининга на смъртоносността на синтетични материали

Синтетичен леталитет възниква, когато едновременната загуба на два гена води до клетъчна смърт, докато загубата само на един от тях се понася. При рака специфичните за тумора мутации създават зависимости от партньорски гени, които се превръщат в терапевтични цели. Инхибирането на тези партньорски гени селективно убива раковите клетки, които са носители на сенсибилизиращата мутация, като същевременно щади нормалните клетки с непокътнати компенсаторни пътища.

Изчерпателната геномна анотация на панела NCI-60 позволява стратифициране на клетъчните линии по статус на мутация за сравнителен скрининг. Клетъчните линии, съдържащи специфични мутации, които представляват интерес, се сравняват с линиите от див тип, за да се идентифицират гените, които са селективно съществени в контекста на мутацията. Това подобно на изогенно сравнение в генетично разнообразен панел идентифицира стабилни синтетични летални взаимодействия с потенциал за клинично приложение.

Високопроизводителните технологии за скрининг позволяват изследване на синтетичните летални взаимодействия в геномен мащаб. siRNA и shRNA библиотеки, насочени към всички човешки гени, систематично идентифицират гени, които са от съществено значение за оцеляването на раковите клетки. Скринингите за нокаут на CRISPR-Cas9 осигуряват по-голяма прецизност и намаляват ефектите извън целта, които затрудняваха по-ранните подходи на RNAi. И двете технологии са успешно приложени в клетъчни линии от панела на NCI.

BRCA-PARP Синтетична парадигма на смъртност

Синтетичното смъртоносно взаимодействие между загубата на BRCA1/2 и инхибирането на PARP е пример за успешен преход от скрининги на клетъчни линии към одобрени терапии за рак. Клетките с дефицит на BRCA, които не могат да извършват поправка на ДНК чрез хомоложна рекомбинация, зависят от PARP-медиираната поправка на изрязване на бази, за да оцелеят. Инхибирането на PARP в BRCA-мутантните клетки води до натрупване на ДНК увреждания и клетъчна смърт.

Клетъчните линии от панела на NCI са от съществено значение за потвърждаване на BRCA-PARP синтетичния леталитет и за характеризиране на детерминантите на чувствителността към PARP инхибитори. Освен зародишните BRCA мутации, соматичните мутации и епигенетичното заглушаване на гените за хомоложна рекомбинация създават фенотипи на "BRCAness", които предсказват отговора към PARP инхибитора. Скринингът на клетъчни линии идентифицира тези алтернативни дефекти, разширявайки популацията, която потенциално може да се възползва от инхибирането на PARP.

Клетките HCT116 с дефицит на MLH1 осигуряват MSI-високи модели за оценка на инхибиторите на пътищата за възстановяване на ДНК. Изогенните двойки клетъчни линии с определени генетични модификации позволяват контролирано валидиране на синтетичната смъртност. Клетките DLD-1 и SW620 допринасят за допълнителни модели на колоректален рак с различен статус на пътя на възстановяване на ДНК.

CRISPR-базиран скрининг в целия геном

Технологията CRISPR-Cas9 направи революция в скрининга на синтетичната смъртност, като позволи прецизно изключване на гени с минимални ефекти извън целта. Геномни CRISPR библиотеки, съдържащи водещи РНК, насочени към всички човешки гени, се доставят на популации от клетъчни линии, а изчерпването на водачите с течение на времето идентифицира гени, които са от съществено значение за оцеляването на клетките. Сравнителният скрининг на клетъчни линии от панела на NCI идентифицира зависими от контекста съществени гени, представляващи синтетични смъртоносни взаимодействия.

Проектът Achilles и свързаните с него инициативи са провели систематични CRISPR скрининги в стотици ракови клетъчни линии, включително членове на NCI-60. Получените карти на зависимостите разкриват общи съществени гени, изисквани от всички ракови клетки, и специфични за контекста зависимости, свързани с конкретни мутации. Този ресурс дава възможност за извличане на синтетични смъртоносни взаимодействия без провеждане на нови скрининги.

Клетъчните линии с мутации на KRAS демонстрират зависимости от членове на пътя на KRAS, които потенциално могат да бъдат насочени чрез подходи за синтетична смъртност. Клетките A549, носещи мутации на KRAS G12S, показват зависимост от компоненти на пътя SHP2, RAF и MEK. Клетките NCI-H358 с KRAS G12C дават възможност за оценка на алелно-специфичните взаимодействия на синтетичната смъртност. Клетките NCI-H460 осигуряват допълнителни модели на едроклетъчен белодробен карцином с мутации на KRAS.

Подходи за изчислително прогнозиране

Големите мултиомични набори от данни, генерирани от панелите на NCI, позволяват компютърно предсказване на синтетични летални взаимодействия. Алгоритмите за машинно обучение, обучени върху известни синтетични летални двойки, идентифицират характеристики, предсказващи генетични взаимодействия. Тези изчислителни подходи приоритизират кандидат-взаимодействията за експериментално валидиране, като намаляват тежестта на скрининга на всяка възможна генна комбинация.

Анализът на корелацията на генната експресия идентифицира гени, които се експресират съвместно в клетъчни линии NCI-60, което предполага функционални връзки. Моделите на антикорелирана експресия могат да показват синтетични летални взаимоотношения, при които компенсацията се осъществява на ниво експресия. Интегрирането на данните за експресията с мрежите за генетично взаимодействие от моделни организми пренася знанията в контекста на човешкия рак.

Анализът на ниво пътища групира синтетичните летални взаимодействия по функционални категории. Реакцията на ДНК увреждане, регулирането на клетъчния цикъл и метаболитните пътища са обогатени със синтетични летални взаимодействия, които могат да се използват терапевтично. Тази перспектива на пътищата насочва избора на мишени към взаимодействия с множество възли, които могат да се лекуват.

Пристрастяване към онкогени и синтетична смъртност

Пристрастяването към онкогени представлява специален случай на синтетична смъртност, при който раковите клетки зависят от постоянната активност на водещите онкогени. Оттеглянето на онкогенната сигнализация чрез генетични или фармакологични средства води до клетъчна смърт въпреки наличието на други мутации. Скринингът на панела на NCI идентифицира гени, които се изискват специално в контекста на онкогенното задвижване.

Клетъчните линии, управлявани от MYC в рамките на NCI-60, демонстрират зависимост от регулираните от MYC метаболитни и биосинтетични програми. Въпреки че самият MYC остава предизвикателство за пряко насочване, синтетичните смъртоносни партньори, включително CDK9, AURKA и метаболитни ензими, осигуряват алтернативни точки за намеса. Скринингът на MYC-амплифицирани спрямо диплоидни клетъчни линии идентифицира тези таргетни зависимости.

Клетките K562, управлявани от BCR-ABL, демонстрират дълбока онкогенна зависимост, използвана от иматиниб и свързаните с него ТКИ. Този модел позволява да се изследват механизмите, поддържащи онкогенната зависимост, и стратегиите за преодоляване на придобитата резистентност. Клетките HL-60 предоставят модели на остра миелоидна левкемия с амплификация на MYC за изследвания на синтетичната смъртност.

Утвърждаване и клинично приложение

Синтетичните смъртоносни взаимодействия, идентифицирани чрез скрининг на панела на NCI, изискват строго валидиране преди клинично приложение. Независимото потвърждаване с помощта на ортогонални методи (различни RNAi реагенти, CRISPR, малки молекули) установява надеждност. Валидирането в множество клетъчни линии с общи мутации демонстрира възможност за обобщаване извън контекста на отделните клетъчни линии.

Моделите на ксенографти, получени от пациенти (PDX), осигуряват клинично значими условия за валидиране на синтетичната смъртност. Лекарствените комбинации, използващи синтетични летални взаимодействия, се оценяват в PDX модели, получени от пациенти със съответните мутации. Това поетапно валидиране повишава увереността в клиничното приложение чрез демонстриране на активност в модели, поддържащи туморна хетерогенност на пациентите.

Осигуряването на качеството гарантира надеждни резултати от скрининга. Удостоверяването на клетъчната линия потвърждава идентичността на клетъчната линия, което е от съществено значение предвид документираните проблеми с неправилната идентификация. Тестването на микоплазми поддържа целостта на културите по време на кампаниите за скрининг. Средата RPMI 1640 и DMEM осигуряват стандартизирани условия за култивиране за последователни резултати от скрининга.

Нови синтетични смъртоносни цели

Освен инхибиторите на PARP, множество синтетични смъртоносни терапевтични стратегии напредват в клиничната разработка. Мутантните ракови заболявания ARID1A демонстрират синтетична смъртност с инхибиране на EZH2, което води до разработване на таземетостат за епителиоиден сарком и фоликуларен лимфом. Инхибиторите на ATR и CHK1 използват синтетичен леталитет при АТМ-дефицитни ракови заболявания, които не могат да активират алтернативни контролни точки за ДНК увреждане.

Метаболитната синтетична смъртност е насочена към специфични за рака метаболитни зависимости. Тумори със специфична активация на онкогени или загуба на туморни супресори демонстрират променено използване на метаболитни пътища, което създава уязвимости, които могат да бъдат използвани като лекарства. Данните за метаболомиката и чувствителността към лекарства на панела на NCI дават информация за идентифицирането на метаболитни синтетични летални взаимодействия.

Синтетичният леталитет при имунотерапията представлява нова концепция, при която генетичните промени предсказват отговора към инхибиторите на имунните контролни точки. Загубата на гени за механизмите за представяне на антигени създава зависимост от инхибирането на контролните точки за избягване на имунната защита. Характеристиката на панела на NCI за експресия на гени, свързани с имунната система, дава информация за прогнозиране на синтетичната смъртност при имунотерапия.

Заключение

Панелите от ракови клетъчни линии на NCI осигуряват основни платформи за систематично идентифициране и валидиране на синтетичните летални взаимодействия. Успехът на синтетичната смъртност на BRCA-PARP демонстрира потенциала за приложение на откритията, базирани на клетъчни линии. Напредъкът в CRISPR скрининговата технология и подходите за компютърно прогнозиране продължават да разширяват каталога на използваемите синтетични летални взаимодействия. Интегрирането на данните от скрининга с клинично валидиране в модели, получени от пациенти, ускорява трансформирането на откритията за синтетична смъртност в подобрено лечение на рака.