Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

SNU 胃肠癌细胞的球形体形成规程

与传统的二维单层培养相比，三维（3D）细胞培养系统提供的模型能更准确地再现肿瘤微环境，从而彻底改变了癌症研究。来自韩国胃癌和结直肠癌患者的 SNU 胃肠癌细胞系具有强大的球形细胞形成能力，可用于研究耐药机制、肿瘤异质性和癌症干细胞生物学。为 SNU 细胞系建立标准化的球形体形成协议可确保各实验室的可重复性，并促进转化研究的应用。

主要收获

• SNU 胃癌和结直肠癌细胞系可形成紧凑、可重复的球形体，适合药物筛选应用
• 超低附着面和悬滴法可产生不同应用的球形体形态
• 球形体的大小和压实度与 SNU 模型中的药物渗透和抗药性表型有关
• 结合基质细胞和免疫细胞的共培养球体可模拟肿瘤微环境
• 标准化方案可利用 SNU 细胞系进行基于球形体的高通量药物筛选

超低附着力表面球形细胞的形成

超低附着力（ULA）培养板是生成均匀 SNU 癌细胞球的最广泛采用的方法。这些培养板具有共价结合的水凝胶表面，可防止细胞粘附，迫使细胞聚集并形成三维结构。ULA 板的圆底几何形状可促进每孔形成单个球形细胞，从而实现定量检测，并将孔与孔之间的差异降至最低。

对于 SNU 胃癌细胞系，最佳播种密度为每孔 500 到 5,000 个细胞，具体取决于特定的细胞系和预期的球形细胞大小。较低的播种密度能产生更小、更紧凑的球形体，适合药物渗透研究，而较高的播种密度则能产生更大的球形体，形成模拟血管不畅肿瘤区域的坏死核心。由于不同的 SNU 品系表现出不同的聚集动力学和压实特性，因此针对细胞系进行优化至关重要。

AGS 细胞是一种常用的胃腺癌模型，可在播种后 48-72 小时内形成紧密的球形。MKN-45 细胞的聚集速度更快，但形成的结构却不那么紧密，而KATO-III 细胞则因其招牌环细胞特征而呈现出独特的球形形态。MKN-74 细胞提供了一种适合球形培养的肠型分化模型。

悬滴法控制球形细胞大小

悬滴技术通过将确定体积的细胞悬挂在倒置的培养表面，可精确控制初始细胞数量和由此产生的球形体尺寸。这种方法无需使用专门的平板，并能产生对标准化药物筛选应用至关重要的高重复性球形体尺寸。重力将细胞聚集在悬滴顶点，形成不受基质相互作用影响的球形。

用于 SNU 细胞系的标准悬滴方案采用 20-25 μL 液滴，在完全培养基中含有 1,000-5,000 个细胞。经过 24-48 小时的初步聚集后，球体被转移到 ULA 板或悬浮培养液中继续成熟。在悬滴培养基中加入甲基纤维素（0.24% w/v）可增加粘度，防止悬滴扩散，从而提高球体的均匀性。

结直肠癌球形模型的应用范围超出了胃癌。HCT116 细胞可形成结构紧凑、重现性高的球形体，适合高通量筛选应用。Caco-2 细胞在球体内形成极化上皮结构，而DLD-1 细胞和SW620 细胞则提供了具有不同遗传背景的其他结直肠腺癌模型。

优化球形体形成的培养基

培养基成分对 SNU 细胞系球形体的形成效率、形态和活力有重大影响。标准单层培养基通常需要补充基底膜提取物或改良血清浓度，以促进球形体的压实。选择合适的基础培养基和添加剂决定了球形体的质量和实验的可重复性。

RPMI 1640 培养基是大多数 SNU 胃肠癌细胞系的标准基础培养基。将血清从标准的 10%降至 2-5% 的胎牛血清，可通过减少细胞-基质附着信号来促进球形体的压实。使用 EGF 和 bFGF 补充生长因子，有助于富集球体内的癌症干细胞，从而对肿瘤启动细胞群进行研究。

DMEM/Ham's F12 培养基组合为需要不同营养成分的特定 SNU 细胞系提供了替代基础培养基。添加 B27 补充剂和 N2 补充剂可进一步丰富球体内的干样细胞群。冷冻培养基 CM-1可以对球形培养物进行冷冻保存，以实现长期储存和实验一致性。

球形体尺寸和压实度分析

球形体尺寸和压实状态的定量评估提供了重要的质量控制指标和实验终点。自动成像平台可捕捉单个球形体的明视野或相位对比图像，通过算法测量直径、圆度和表面不规则度。这些参数与球体成熟度相关，并可预测药物渗透特性。

SNU 胃癌球体通常在培养第 5-7 天达到直径 300-500 μm 的稳定尺寸，具体取决于初始播种密度和细胞系。直径超过 500 μm 的球体会形成中心缺氧核心，引发 HIF 通路激活和代谢重编程，从而模拟缺氧的肿瘤微环境。这种低氧梯度会影响球形体模型的药物反应和耐药性发展。

根据相对于初始细胞数的球形面积计算出的压实指数可将紧密的上皮型球形与疏松的间充质型聚集体区分开来。E-cadherin高表达的SNU细胞系比经历了上皮-间质转化的细胞系形成的球体更紧密。这种形态变化与临床观察到的转移潜力和药物敏感性模式相关。

肿瘤微环境的共培养小球模型

肿瘤进展和药物反应主要取决于癌细胞与基质成分（包括成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞）之间的相互作用。包含多种细胞类型的共培养球形系统以三维结构模拟了这些相互作用，揭示了基质对抗药性和免疫逃避的作用。SNU 细胞系很容易与各种基质细胞群形成异型球体。

癌症相关成纤维细胞（CAF）与SNU胃癌细胞共同培养产生的球形体与单培养球形体相比具有更强的耐药性。CAF衍生因子（包括HGF和IL-6）可激活癌细胞的存活途径，并重塑球体内的细胞外基质。癌细胞与成纤维细胞的比例可以调节，以模拟不同程度的基质浸润。

通过免疫细胞共培养，可以研究球体内肿瘤与免疫的相互作用。分化为巨噬细胞的THP-1 细胞浸润 SNU 球形体，并形成肿瘤相关巨噬细胞表型。Jurkat E6.1 细胞可提供 T 细胞模型，用于研究球形细胞共培养中的免疫疗法反应，而K562 细胞则可用于自然杀伤细胞细胞毒性研究。

基于球形细胞的高通量药物筛选

自动化球形培养平台可利用 SNU 胃肠道癌症模型进行可扩展的药物筛选。机器人液体处理系统可将细胞播种到 384 孔 ULA 板中，添加多种浓度的化合物，并利用集成成像技术监测球体随时间变化的反应。这种高通量格式可在治疗相关的三维培养环境中生成化合物库的剂量反应数据。

球状体活力评估采用发光 ATP 定量（CellTiter-Glo 3D）或与高通量阅读器兼容的荧光细胞死亡指示剂（碘化丙啶、SYTOX 染料）。与单层培养相比，三维培养需要更长的药物暴露时间，通常为 72-120 小时，以考虑药物渗透动力学和较慢的增殖速度。这种延长的暴露时间可以识别出短期单层检测中遗漏的具有延迟活性的化合物。

高通量球形筛选的质量控制需要经过认证的细胞系和标准化方案。细胞系认证服务在启动筛选活动之前，通过 STR 图谱验证 SNU 细胞系的身份。支原体检测可确保球形体培养的完整性，因为支原体污染会改变球形体的形成和药物反应特性。

结论

SNU 胃肠癌细胞系的标准化球形形成方案为药物发现和癌症生物学研究提供了强大的三维模型。通过选择适当的形成方法、优化培养条件和实施定量质量指标，研究人员可以生成适合高通量应用的可重复球形培养物。基质和免疫成分的加入进一步增强了这些模型的生理相关性，有助于将实验室研究成果转化为临床效益。