Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

SNU seedetrakti vähirakkude sferoidi moodustamise protokollid

Kolmemõõtmelised (3D) rakukultuurisüsteemid on revolutsiooniliselt muutnud vähiuuringuid, pakkudes mudeleid, mis taastavad täpsemalt kasvaja mikrokeskkonda võrreldes traditsiooniliste kahemõõtmeliste monokihiliste kultuuridega. SNU seedetrakti vähirakuliinid, mis on saadud Korea mao- ja kolorektaalvähi patsientidelt, näitavad tugevat sferoidi moodustamise võimet, mis võimaldab uurida ravimresistentsuse mehhanisme, kasvaja heterogeensust ja vähi tüvirakkude bioloogiat. SNU rakuliinide standardiseeritud sferoidi moodustamise protokollide kehtestamine tagab laboratooriumide vahelise reprodutseeritavuse ja hõlbustab translatiivsete teadusuuringute rakendusi.

Peamised järeldused

• SNU mao- ja kolorektaalvähi rakuliinid moodustavad kompaktseid, reprodutseeritavaid sferoide, mis sobivad ravimite skriiningu rakendusteks
• Ülimadalad kinnituspinnad ja rippuvate tilkade meetodid annavad erinevate rakenduste puhul erinevad sferoidide morfoloogiad
• Sferoidide suurus ja tihendamine korreleeruvad SNU mudelites ravimite penetratsiooni ja resistentsuse fenotüüpidega
• Stroomi- ja immuunrakke sisaldavate ko-kultuuride sferoidid modelleerivad kasvaja mikrokeskkonda
• Standardiseeritud protokollid võimaldavad suure läbilaskevõimega sferoididel põhinevat ravimite sõelumist SNU rakuliinide abil

Ülimadalate kinnituspindade sfäärikujuliste moodustamine

Ultra-madalalt kinnituvad (ULA) kultuuriplaadid on kõige laialdasemalt kasutatav meetod ühtlaste SNU vähirakkude sferoidide loomiseks. Nendel plaatidel on kovalentselt seotud hüdrogeelipinnad, mis takistavad rakkude adhesiivsust, sundides rakke koonduma ja moodustama kolmemõõtmelisi struktuure. ULA-plaatide ümmarguse põhja geomeetria soodustab ühe sferoidi moodustumist kaevu kohta, võimaldades kvantitatiivseid analüüse minimaalse varieeruvusega kaevude vahel.

SNU maovähi rakuliinide puhul on optimaalne külvitihedus 500-5000 rakku kaevu kohta, sõltuvalt konkreetsest rakuliinist ja kavandatud sferoidi suurusest. Väiksemad külvitihedused annavad väiksemaid, kompaktsemaid sferoide, mis sobivad ravimite penetratsiooni uuringuteks, samas kui suuremad tihedused tekitavad suuremaid sferoide, milles tekivad nekrootilised südamikud, mis jäljendavad halvasti vaskulariseeritud kasvaja piirkondi. Oluline on rakuliinispetsiifiline optimeerimine, kuna erinevatel SNU liinidel on erinev agregatsioonikineetika ja tihendamisomadused.

AGS-rakud esindavad tavaliselt kasutatavat mao adenokartsinoomi mudelit, mis moodustab tihedaid sferoide 48-72 tunni jooksul pärast külvamist. MKN-45 rakud näitavad kiiremat agregatsiooni, kuid moodustavad vähem kompaktseid struktuure, samal ajal kui KATO-III rakud on unikaalse sferoidi morfoloogiaga, mis tuleneb nende sigaretirõngaste omadustest. MKN-74 rakud pakuvad soolestiku tüüpi diferentseerumise mudelit, mis on sobilik sferoidide kasvatamiseks.

Rippuvate tilkade meetod kontrollitava sferoidi suuruse saavutamiseks

Rippuvate tilkade meetod võimaldab täpselt kontrollida rakkude algset arvu ja saadud sferoidi mõõtmeid, kuna rakkude kindlaksmääratud kogused riputatakse ümberpööratud kultiveerimispinnale. See meetod välistab vajaduse spetsiaalsete plaatide järele ja annab väga hästi korratava sferoidi suuruse, mis on oluline standardiseeritud ravimite sõeluuringute jaoks. Gravitatsioonijõud agregeerib rakud tilga tipus, moodustades substraadi koostoimetest sõltumatuid sferoide.

SNU rakuliinide standardse rippumise protokollide puhul kasutatakse 20-25 μl tilka, mis sisaldavad 1000-5000 rakku täielikus kultuurikeskkonnas. Pärast 24-48 tundi kestnud esialgset agregatsiooni viiakse sferoidid üle ULA-plaatidele või suspensioonikultuuri, et jätkata küpsemist. Metüültselluloosi (0,24% w/v) lisamine rippuvale tilgakeskkonnale suurendab viskoossust ja takistab tilkade levikut, parandades sferoidide ühtlikkust.

Kolorektaalvähi sferoidmudelid ulatuvad kaugemale kui maovähi rakendused. HCT116 rakud moodustavad kompaktseid, väga hästi reprodutseeritavaid sferoide, mis sobivad kõrge läbilaskevõimega sõeluuringurakendusteks. Caco-2 rakud arendavad sferoidides polariseeritud epiteelarhitektuuri, samas kui DLD-1 rakud ja SW620 rakud pakuvad täiendavaid kolorektaalse adenokartsinoomi mudeleid, millel on erinev geneetiline taust.

Kultuurikeskkonna optimeerimine sferoidide moodustamiseks

Kultuurikeskkonna koostis mõjutab oluliselt SNU rakuliini sferoidide moodustamise tõhusust, morfoloogiat ja elujõulisust. Standardsed monokihilised kultuurikeskkonnad vajavad tavaliselt baasmembraani ekstrakti või modifitseeritud seerumi kontsentratsioonide lisamist, et soodustada sferoidide tihendamist. Sobiva baassöötme ja lisaainete valik määrab sferoidide kvaliteedi ja eksperimentaalse reprodutseeritavuse.

Enamiku SNU seedetrakti vähirakuliinide standardse põhikeskkonnana kasutatakseRPMI 1640 keskkonda. Seerumi vähendamine standardselt 10%-lt 2-5%-ni veise loote seerumist soodustab sferoidide tihendamist, vähendades raku-substraadi kinnitumise signalisatsiooni. Kasvufaktorite lisamine EGF ja bFGF abil toetab vähi tüvirakkude rikastamist sferoidides, võimaldades kasvajat algatavate rakupopulatsioonide uurimist.

DMEM/Ham's F12 Mediumi kombinatsioonid pakuvad alternatiivseid baasmediume konkreetsete SNU rakuliinide jaoks, mis vajavad erinevat toitainete koostist. B27- ja N2-lisandi lisamine rikastab veelgi tüvede sarnaseid populatsioone sferoidides. Freeze Medium CM-1 võimaldab sferoidikultuuride krüokonserveerimist pikaajaliseks säilitamiseks ja katsete järjepidevuse tagamiseks.

Sferoidide suuruse ja tihendamise analüüs

Sferoidide mõõtmete ja tihendamise seisundi kvantitatiivne hindamine annab olulised kvaliteedikontrolli mõõdikud ja eksperimentaalsed lõpp-punktid. Automatiseeritud pildistamisplatvormid jäädvustavad üksikute sferoidide heledavälja või faasikontrasti pilte, mis võimaldavad algoritmiliselt mõõta läbimõõtu, ümarust ja pinna ebakorrapärasust. Need parameetrid korreleeruvad sferoidi küpsusega ja ennustavad ravimi penetratsiooni omadusi.

SNU maovähi sferoidid saavutavad tavaliselt stabiilse 300-500 μm läbimõõdu 5-7. kultuuripäevaks, sõltuvalt algsest külvitihedusest ja rakuliinist. Üle 500 μm läbimõõduga sferoididel tekivad keskmised hüpoksilised südamikud, mis käivitavad HIF-radade aktiveerimise ja ainevahetuse ümberprogrammeerimise, modelleerides hüpoksilist kasvajakeskkonda. See hüpoksiline gradient mõjutab ravimivastust ja resistentsuse arengut sferoidide mudelites.

Sferoidi pindala ja rakkude algarvu põhjal arvutatud tihendusindeksid eristavad tihedaid epiteliaalset tüüpi sferoide lahtistest, mesenhüümset tüüpi agregaatidest. Kõrge E-kadheriini ekspressiooniga SNU rakuliinid moodustavad kompaktsemaid sferoide kui rakuliinid, mis on läbinud epiteliaalse-mesenhüümilise ülemineku. See morfoloogiline erinevus korreleerub kliiniliselt täheldatud metastaatilise potentsiaali ja ravimitundlikkusega.

Kasvaja mikrokeskkonna ko-kultuuride sferoidmudelid

Kasvaja progresseerumine ja ravivastus sõltuvad olulisel määral vähirakkude ja stroomi komponentide, sealhulgas fibroblastide, endoteelirakkude ja immuunsüsteemi rakkude vahelisest koostoimest. Ko-kultuuri sferoidisüsteemid, mis sisaldavad mitmeid rakutüüpe, modelleerivad neid vastastikmõjusid kolmemõõtmelises arhitektuuris, paljastades stroomi panuse ravimresistentsusesse ja immuunsüsteemi vältimisse. SNU rakuliinid moodustavad kergesti heterotüüpseid sferoide koos erinevate stroomi rakupopulatsioonidega.

Vähiga seotud fibroblastide (CAF) kooskultuur SNU maovähirakkudega tekitab monokultuursete sferoididega võrreldes suurema ravimresistentsusega sferoidid. CAF-ist pärinevad tegurid, sealhulgas HGF ja IL-6, aktiveerivad vähirakkude ellujäämisradasid ja kujundavad ümber ekstratsellulaarse maatriksi sferoidides. Vähirakkude ja fibroblastide suhet saab tiitrida, et modelleerida erinevaid stroomi infiltratsiooni astmeid.

Immuunirakkude kooskultuur võimaldab uurida kasvajate ja immuunsüsteemi vastastikmõju sferoidide arhitektuuris. Makrofaagideks diferentseeritud THP-1 rakud infiltreeruvad SNU sferoididesse ja võtavad üle kasvajaga seotud makrofaagide fenotüübi. Jurkat E6.1 rakud pakuvad T-rakkude mudeleid immunoteraapia vastuse uurimiseks sferoidide kooskultuurides, samas kui K562 rakud võimaldavad looduslike tapjarakkude tsütotoksilisuse uuringuid.

Kõrge läbilaskevõimega sferoidipõhine ravimite skriining

Automatiseeritud sferoidikultuuriplatvormid võimaldavad skaleeritavat ravimite skriiningut, kasutades SNU seedetrakti vähimudeleid. Robootilised vedelikukäitlussüsteemid külvavad rakud 384-kujulistesse ULA-plaatidesse, lisavad ühendid mitmes kontsentratsioonis ja jälgivad sferoidide reaktsiooni aja jooksul integreeritud pildistamise abil. See suure läbilaskevõimega formaat genereerib andmeid annuse-vastuse kohta ühendite raamatukogude kohta terapeutiliselt asjakohastes kolmemõõtmelistes kultuurikontekstides.

Sferoidide elujõulisuse hindamisel kasutatakse luminestsentset ATP kvantifitseerimist (CellTiter-Glo 3D) või fluorestseeruvaid rakusurma indikaatoreid (propidiumjodiid, SYTOX värvained), mis sobivad kõrge läbilaskevõimega lugejatega. Kolmemõõtmelised kultuurid vajavad monokihiga võrreldes pikemat ravimiga kokkupuute aega, tavaliselt 72-120 tundi, et võtta arvesse ravimi penetratsiooni kineetikat ja aeglasemat proliferatsiooni kiirust. Selline pikem kokkupuute kestus võimaldab tuvastada ühendid, mille toime on hilinenud ja mis lühiajalistes monokihiliste katsetes on jäänud tähelepanuta.

Kvaliteedikontroll kõrge läbilaskevõimega sferoidide skriiningus nõuab autentseid rakuliine ja standardiseeritud protokollid. Rakuliinide autentimise teenused kontrollivad SNU rakuliinide identiteeti STR-profiilide abil enne sõelumiskampaaniate alustamist. Mükoplasma testimine tagab sferoidikultuuri terviklikkuse, kuna mükoplasmakontaminatsioon muudab sferoidi moodustumist ja ravimi reaktsiooni omadusi.

Kokkuvõte

SNU seedetrakti vähirakuliinide standardiseeritud sferoidide moodustamise protokollid pakuvad usaldusväärseid kolmemõõtmelisi mudeleid ravimite avastamiseks ja vähibioloogia uurimiseks. Valides sobivad moodustamismeetodid, optimeerides kasvatustingimusi ja rakendades kvantitatiivseid kvaliteedimõõdikuid, saavad teadlased luua reprodutseeritavaid sferoidikultuure, mis sobivad kõrge läbilaskevõimega rakendusteks. Stroomi ja immuunsüsteemi komponentide lisamine suurendab veelgi nende mudelite füsioloogilist asjakohasust, toetades laboratoorsete tulemuste ülekandmist kliinilise kasu saamiseni.