Spheroid Formation Protocols for SNU Gastrointestinal Cancer Cells

SNU virškinimo trakto vėžio ląstelių sferoidų formavimo protokolai

Trimatės (3D) ląstelių kultūrų sistemos sukėlė revoliuciją vėžio tyrimuose, nes, palyginti su tradicinėmis dvimatėmis viensluoksnėmis kultūromis, jos tiksliau atkartoja naviko mikroaplinką. SNU virškinamojo trakto vėžio ląstelių linijos, gautos iš Korėjos skrandžio ir storosios žarnos vėžiu sergančių pacientų, pasižymi stipriu sferoidų formavimosi gebėjimu, leidžiančiu tirti atsparumo vaistams mechanizmus, naviko heterogeniškumą ir vėžio kamieninių ląstelių biologiją. Standartizuotų SNU ląstelių linijų sferoidų formavimo protokolų sukūrimas užtikrina atkuriamumą įvairiose laboratorijose ir palengvina taikomųjų tyrimų taikymą.

Pagrindinės išvados

• SNU skrandžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių linijos formuoja kompaktiškus, atkuriamus sferoidus, tinkamus vaistų atrankinei patikrai
• Itin maži tvirtinimo paviršiai ir kabančių lašų metodai leidžia gauti skirtingas sferoidų morfologijas, kurias galima pritaikyti įvairiose srityse
• Sferoidų dydis ir sutankinimas koreliuoja su vaistų skverbtimi ir atsparumo fenotipais SNU modeliuose
• Sferoidai, kuriuose yra stromos ir imuninių ląstelių, modeliuoja naviko mikroaplinką
• Standartizuoti protokolai leidžia atlikti didelio našumo sferoidais pagrįstą vaistų atranką naudojant SNU ląstelių linijas

Itin mažo tvirtinimo paviršiaus sferoidų formavimas

Ypač mažo prisitvirtinimo (ULA) kultūrų plokštelės yra plačiausiai paplitęs metodas vienodiems SNU vėžinių ląstelių sferoidams formuoti. Šiose plokštelėse yra kovalentiniu būdu surišti hidrogeliniai paviršiai, kurie neleidžia ląstelėms sukibti, todėl jos priverstos susitelkti ir formuoti trimates struktūras. ULA plokštelių apvalaus dugno geometrija skatina formuoti vieną sferoidą duobutėje, todėl galima atlikti kiekybinius tyrimus su minimaliu skirtumu tarp duobučių.

Optimalus SNU skrandžio vėžio ląstelių linijų pasėjimo tankis svyruoja nuo 500 iki 5000 ląstelių duobutėje, priklausomai nuo konkrečios ląstelių linijos ir numatomo sferoido dydžio. Mažesniu tankumu sėjant ląsteles gaunami mažesni, kompaktiškesni sferoidai, tinkami vaistų skvarbos tyrimams, o didesniu tankumu - didesni sferoidai, kuriuose susidaro nekrotiniai branduoliai, imituojantys prastai vaskuliarizuotas naviko sritis. Labai svarbu optimizuoti konkrečią ląstelių liniją, nes skirtingoms SNU linijoms būdinga skirtinga agregacijos kinetika ir sutankinimo savybės.

AGS ląstelės yra plačiai naudojamas skrandžio adenokarcinomos modelis, kuris per 48-72 valandas nuo pasėjimo suformuoja glaudžius sferoidus. MKN-45 ląstelės agreguojasi greičiau, tačiau formuoja ne tokias kompaktiškas struktūras, o KATO-III ląstelės pasižymi unikalia sferoidų morfologija dėl savo signeto žiedo ląstelių savybių. MKN-74 ląstelės - tai žarnyno tipo diferenciacijos modelis, tinkantis sferoidinei kultūrai.

Kabančių lašų metodas kontroliuojamam sferoidų dydžiui nustatyti

Kabančių lašų metodas leidžia tiksliai kontroliuoti pradinį ląstelių skaičių ir gaunamų sferoidų matmenis, sustabdant tam tikrus ląstelių kiekius ant apverstų kultūrų paviršių. Taikant šį metodą nereikia naudoti specialių plokštelių ir gaunami labai atkuriami sferoidų dydžiai, kurie yra labai svarbūs standartinėms vaistų atrankos programoms. Gravitacinė jėga sutelkia ląsteles lašelio viršūnėje ir suformuoja sferoidus nepriklausomai nuo substrato sąveikos.

Standartiniuose kabančių lašų protokoluose SNU ląstelių linijoms naudojami 20-25 μl lašai, kuriuose yra 1 000-5 000 ląstelių pilnoje mitybinėje terpėje. Praėjus 24-48 valandoms po pradinio susitelkimo, sferoidai perkeliami į ULA plokšteles arba suspensijos kultūrą, kad toliau bręstų. Į kabančių lašų terpę pridėjus metilceliuliozės (0,24 % w/v), padidėja klampumas ir neleidžiama lašams išsisklaidyti, todėl pagerėja sferoidų vienodumas.

Storosios žarnos vėžio sferoidų modeliai taikomi ne tik skrandžio vėžiui gydyti. HCT116 ląstelės formuoja kompaktiškus, labai atkuriamus sferoidus, tinkamus didelio našumo tyrimams. Caco-2 ląstelės sukuria poliarizuotą epitelio struktūrą sferoiduose, o DLD-1 ląstelės ir SW620 ląstelės yra papildomi storosios žarnos adenokarcinomos modeliai su skirtingais genetiniais pagrindais.

Kultūros terpės optimizavimas sferoidų formavimui

Kultūrinės terpės sudėtis turi didelę įtaką SNU ląstelių linijos sferoidų formavimo efektyvumui, morfologijai ir gyvybingumui. Standartines viensluoksnes kultūrų terpes paprastai reikia papildyti bazinės membranos ekstraktu arba modifikuoto serumo koncentracija, kad būtų skatinamas sferoidų sutankėjimas. Tinkamos bazinės terpės ir priedų parinkimas lemia sferoidų kokybę ir eksperimentinį atkuriamumą.

RPMI 1640 terpė yra standartinė bazinė terpė daugumai SNU virškinimo trakto vėžio ląstelių linijų. Sumažinus serumo kiekį nuo standartinio 10 % iki 2-5 % fetalinio galvijų serumo, skatinamas sferoidų sutankėjimas, nes sumažėja ląstelių ir substrato prisijungimo signalas. Augimo faktorių papildymas EGF ir bFGF skatina vėžio kamieninių ląstelių gausinimą sferoiduose, todėl galima tirti naviką inicijuojančių ląstelių populiacijas.

DMEM ir Ham's F12 terpių deriniai yra alternatyvios bazinės terpės konkrečioms SNU ląstelių linijoms, kurioms reikia skirtingos maistinių medžiagų sudėties. Pridėjus B27 priedo ir N2 priedo, dar labiau praturtinamos kamieninių ląstelių populiacijos sferoiduose. Užšaldymo terpė CM-1 leidžia kriokonservuoti sferoidines kultūras, kad jos būtų ilgai saugomos ir eksperimentiškai pastovios.

Sferoidų dydžio ir sutankinimo analizė

Kiekybinis sferoidų matmenų ir sutankinimo būklės įvertinimas suteikia svarbius kokybės kontrolės rodiklius ir eksperimentų galutinius taškus. Automatizuotos vaizdavimo platformos fiksuoja atskirų sferoidų šviesaus lauko arba fazinio kontrasto vaizdus, todėl galima algoritmiškai išmatuoti skersmenį, apskritimą ir paviršiaus nelygumus. Šie parametrai koreliuoja su sferoidų brandumu ir leidžia prognozuoti vaisto skverbimosi savybes.

SNU skrandžio vėžio sferoidai paprastai pasiekia stabilius 300-500 μm skersmens matmenis iki 5-7 kultūros dienos, priklausomai nuo pradinio sėjimo tankio ir ląstelių linijos. Sferoidai, kurių skersmuo viršija 500 μm, sukuria centrinius hipoksinius branduolius, kurie suaktyvina HIF kelius ir perprogramuoja medžiagų apykaitą, modeliuodami hipoksinę naviko mikroaplinką. Šis hipoksinis gradientas daro įtaką atsakui į vaistus ir atsparumo vystymuisi sferoidų modeliuose.

Pagal sferoido ploto ir pradinio ląstelių skaičiaus santykį apskaičiuoti sutankėjimo indeksai leidžia atskirti glaudžius epitelio tipo sferoidus nuo laisvų mezenchiminio tipo agregatų. SNU ląstelių linijos, kuriose yra didelė E-kadherino raiška, sudaro kompaktiškesnius sferoidus nei ląstelių linijos, kuriose įvyko epitelinis-mezenchiminis virsmas. Šie morfologiniai skirtumai koreliuoja su kliniškai stebimu metastazavimo potencialu ir jautrumo vaistams modeliais.

Ko-kultūrų sferoidų modeliai, kuriuose vaizduojama naviko mikroaplinka

Vėžio progresavimas ir atsakas į vaistus labai priklauso nuo vėžio ląstelių ir stromos komponentų, įskaitant fibroblastus, endotelio ląsteles ir imunines ląsteles, sąveikos. Ko-kultūrų sferoidinės sistemos, apimančios kelių tipų ląsteles, modeliuoja šias sąveikas trimatėje struktūroje, atskleisdamos stromos indėlį į atsparumą vaistams ir imuninės sistemos vengimą. SNU ląstelių linijos lengvai formuoja heterotipinius sferoidus su įvairiomis stromos ląstelių populiacijomis.

Su vėžiu susijusių fibroblastų (CAF) ko-kultūra su SNU skrandžio vėžio ląstelėmis sukuria sferoidus, pasižyminčius didesniu atsparumu vaistams, palyginti su monokultūriniais sferoidais. CAF išskiriami veiksniai, įskaitant HGF ir IL-6, aktyvina vėžio ląstelių išgyvenimo kelius ir pertvarko ekstraląstelinį matriksą sferoiduose. Vėžio ląstelių ir fibroblastų santykis gali būti keičiamas, kad būtų galima modeliuoti skirtingo laipsnio stromos infiltraciją.

Imuninių ląstelių ko-kultūra leidžia tirti naviko ir imuninės sistemos sąveiką sferoidų struktūroje. THP-1 ląstelės, diferencijuotos į makrofagus, įsiskverbia į SNU sferoidus ir įgyja su naviku susijusių makrofagų fenotipus. Jurkat E6.1 ląstelės yra T ląstelių modeliai imunoterapijos atsakui tirti sferoidinėse ko-kulturose, o K562 ląstelės leidžia atlikti natūraliųjų ląstelių žudikių citotoksiškumo tyrimus.

Didelio našumo sferoidų pagrindu atliekama vaistų atranka

Automatizuotos sferoidinių kultūrų platformos suteikia galimybę atlikti vaistų atrankinę patikrą naudojant SNU virškinamojo trakto vėžio modelius. Robotizuotos skysčių tvarkymo sistemos sėja ląsteles į 384 duobučių ULA lėkšteles, prideda kelių koncentracijų junginių ir stebi sferoidų atsaką laikui bėgant, naudodamos integruotą vaizdavimą. Naudojant šį didelio našumo formatą gaunami duomenys apie junginių bibliotekų dozių ir atsako į jas santykį terapiškai svarbiose trimatėse kultūrose.

Sferoidų gyvybingumui įvertinti naudojamas liuminescencinis ATP kiekybinis įvertinimas (CellTiter-Glo 3D) arba fluorescenciniai ląstelių žūties indikatoriai (propidijaus jodidas, SYTOX dažikliai), suderinami su didelio našumo skaitytuvais. Trimatėms kultūroms reikia ilgesnio vaisto poveikio laiko, palyginti su viensluoksnėmis kultūromis, paprastai 72-120 valandų, kad būtų atsižvelgta į vaisto prasiskverbimo kinetiką ir lėtesnį dauginimosi greitį. Tokia ilgesnė poveikio trukmė leidžia nustatyti junginius, kurių aktyvumas vėluoja ir kurių nepavyksta nustatyti atliekant trumpalaikius viensluoksnius tyrimus.

Kokybės kontrolei atliekant didelio našumo sferoidų atrankinę patikrą reikalingos autentiškos ląstelių linijos ir standartizuoti protokolai. Ląstelių linijų autentiškumo nustatymo paslaugos, prieš pradedant atrankinės patikros kampanijas, patikrina SNU ląstelių linijų tapatybę, naudojant STR profilį. Mikoplazmos tyrimas užtikrina sferoidų kultūros vientisumą, nes mikoplazmos užkratas keičia sferoidų formavimąsi ir reakcijos į vaistus savybes.

Išvada

Standartizuoti SNU virškinamojo trakto vėžio ląstelių linijų standartiniai sferoidų formavimo protokolai leidžia sukurti patikimus trimačius modelius vaistų atradimui ir vėžio biologijos tyrimams. Pasirinkę tinkamus formavimo metodus, optimizavę auginimo sąlygas ir įdiegę kiekybinius kokybės rodiklius, mokslininkai gali sukurti atkuriamas sferoidų kultūras, tinkamas didelio našumo taikymams. Stromos ir imuninių komponentų įtraukimas dar labiau padidina šių modelių fiziologinę svarbą, todėl laboratorinių tyrimų rezultatai gali būti pritaikomi klinikinėje praktikoje.